克萊姆森大學開發(fā)直接3D打印微血管化生物墨水

來源：EngineeringForLife

三維（3D）生物打印為體外重建組織和器官提供了強大的平臺，但往往由于打印的組織缺乏血管化而導致無法實現(xiàn)長期培養(yǎng)。過去十年，科學家們通過開發(fā)犧牲生物材料和打印技術來間接構建生物打印結構內的血管網(wǎng)絡。但是，間接方法制造的血管網(wǎng)絡直徑通常大于100μm，使得該方法很難重構更為細微的毛細血管網(wǎng)絡，同時打印后過程（包括去除犧牲材料和內皮化中空網(wǎng)絡）也是復雜且耗時的。相比之下，直接生物打印可以提供一種有效的替代方法。天然生物高分子材料如纖維蛋白、膠原蛋白、明膠和脫細胞基質等，因其具有良好的生物相容性，而被廣泛應用于血管化生物打印。然而，蛋白質衍生生物材料的復雜基質屬性使其促血管生成特性的精細調控復雜化，并使其組成成分受到批次變化的影響。

近期，美國南卡羅來納州克萊姆森大學生物工程系的Ying Mei教授在Biomacromolecules發(fā)表題為Engineering a Chemically Defined Hydrogel Bioink for Direct Bioprinting of Microvasculature的文章。該團隊開發(fā)了一種基于海藻酸鹽的水凝膠生物墨水，通過將RGD（一種用于細胞粘附的整合素結合肽）和一種帶有基質金屬蛋白酶可裂解連接物（MMPQK）的血管內皮生長因子（VEGF）模擬肽對藻酸鹽進行修飾，可用于直接制造微血管組織結構（圖1）。這種水凝膠既可以促進血管形態(tài)發(fā)生，又可以實現(xiàn)遷移細胞的按需隔離。

圖1 應用多肽功能化生物墨水直接打印血管化組織

為了將海藻酸鹽設計成一種具有生物相容性、生物可降解的生物墨水，該團隊通過使用CuAAC“點擊”化學介導的生物偶聯(lián)技術，將具有促進血管生成和血管發(fā)育的RGDSP和MMPQK肽偶聯(lián)到藻酸鹽水凝膠中。內皮細胞中的整合素和血管內皮生長因子受體之間交叉激活將協(xié)同誘導血管生成信號（圖2）。同時，該團隊對這種多肽功能化海藻酸鹽水凝膠進行了物化特性的研究。研究表明，多肽可以成功偶聯(lián)到海藻酸鹽上，且從三種多肽功能化海藻酸鹽（RGD+MMPQK,RGD ONLY,MMPQK ONLY）的儲存模量、損耗模量、水凝膠的微觀結構和電鏡掃描分析都得到相似的值（圖3）。這些結果表明三種水凝膠具有相似的機械和微觀結構特性，為隨后的對比分析中研究多肽對血管形態(tài)的影響提供受控的環(huán)境。

圖2 血管生成水凝膠基質設計思路

圖3 多肽功能化海藻酸鹽水凝膠的表征

為了研究RGD和MMPQK肽對微血管網(wǎng)絡形成的影響，該團隊將人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和人脂肪間充質干細胞（HADSCs）包裹在功能化的藻酸鹽中培養(yǎng)，通過HUVEC面積、平均血管長度、連接數(shù)/mm2三個指標來量化血管形態(tài)發(fā)生。結果表明RGD+MMPQK水凝膠明顯優(yōu)于其他，即支持了先前的研究結果--整合素和血管內皮生長因子受體的共激活導致協(xié)同信號增強血管形態(tài)發(fā)生（圖4a,b,d）。進一步，該團隊發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)絡的形成并不依賴培養(yǎng)基中的可溶性VEGF，而與hADSCs共培養(yǎng)是形成內皮索狀網(wǎng)絡所必需的(圖4c)。當延長培養(yǎng)時間，可在水凝膠內觀察到廣泛的微血管形成(圖4e)，三維重建證明，HUVECs已經聚集成直徑約為9μm管腔網(wǎng)絡(圖4f)。

圖4 多肽功能化海藻酸鹽水凝膠中的血管形態(tài)發(fā)生

為了將多肽功能化水凝膠用于3D生物打印，該團隊通過采用部分離子交聯(lián)的方法，改善了低濃度海藻酸鹽的流變特性(即屈服應力、剪切變稀和粘彈性)，以提高其可打印性。實驗結果表明2%(w/v) 海藻酸鹽溶液與15 mM的CaCl2部分交聯(lián)為最適溶液（圖5）。進一步，該團隊對部分交聯(lián)后的生物墨水進行基準評估。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞均勻懸浮能力、細胞存活率、生物打印的重復性和準確性方面，部分交聯(lián)的海藻酸鹽水凝膠都有顯著改善（圖6）。這些結果表明，部分交聯(lián)水凝膠前體方法為改善低粘度生物墨水可打印性提供了一種有效的策略。

圖5 通過部分離子交聯(lián)調節(jié)海藻酸鹽水凝膠前體的流變性能測試

圖6 部分交聯(lián)RGD+MMPQK海藻酸鹽生物墨水的可打印性測試

為了驗證改良的生物墨水直接打印微血管組織的能力，該團隊制作了VTU，一種由血管和組織特異性成分組成的異質軟組織結構，以模擬軟組織的基質和實質元素。該團隊使用多噴嘴生物打印機，首先使用血管生成墨水打印點陣結構，然后使用第二個噴嘴打印格子空隙內的組織的“芽”（圖7a）。對于組織成分，該團隊使用了異于血管生成生物墨水的RGD功能化生物墨水。通過長時間共培養(yǎng)（7天及14天），血管成分的支柱和連接區(qū)形成了廣泛的微血管網(wǎng)絡，且RGD+MMQPK生物墨水顯著促進了內皮細胞的血管特異性表型和功能。此外，該實驗還發(fā)現(xiàn)，與均質、混合結構相比，異質、分區(qū)的組織結構中的血管形成增強（圖7）。

圖7 用部分交聯(lián)的RGD+MMPQK生物墨水制備VTU

綜上，這些結果不僅為我們的生物墨水支持血管形態(tài)發(fā)生的能力提供了證據(jù)，而且也證明了肽功能化的生物墨水用于直接制造異質微血管組織的可行性研究者所提出的VTU模塊可應用于體外傷口愈合和藥物毒性分析的血管化實驗平臺。