徐銘恩主任：3D打印肝組織單元在藥物篩選中的作用

在第一屆Regenovo生物3D打印學(xué)術(shù)論壇上，浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點實驗室主任徐銘恩教授做了題為“3D打印肝組織單元在藥物篩選中的作用”的演講。在演講中，徐教授介紹了他們在打印肝組織單元中遇到的一些問題和在藥物篩選研究中所做的工作。

浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點實驗室主任

徐銘恩教授

肝臟是人體藥物代謝的主要器官，通過研究藥物在肝臟中的代謝機制，可以幫助我們篩選針對某些疾病的藥物。而通過3D生物打印技術(shù)打印出的肝組織，可以代替實驗動物或器官，應(yīng)用于我們的藥物篩選中。

肝組織單元與3D打印

肝臟是由大概50-100萬的肝小葉結(jié)構(gòu)組成的。因此，我們的設(shè)想是，如果能夠在體外把肝小葉結(jié)構(gòu)設(shè)計好打印出來，并且使它具有功能，就能夠像集成電路一樣把它們集成起來，最后變成一個肝臟。因此，我們的關(guān)注點是在怎樣構(gòu)建肝小葉的層次上的。

肝小葉有很多特殊的結(jié)構(gòu)，如中央靜脈、肝板、肝血竇等。除了細胞本身的表型以外，這些結(jié)構(gòu)對于最后功能的實現(xiàn)也會有影響，這也是3D打印的特長所在，因此我們通過增加表面積、增加內(nèi)部液體的湍流等，研究了這些結(jié)構(gòu)對肝臟的影響。

組織的打印與細胞的培養(yǎng)

首先我們打印了如正方形、三角形等不同結(jié)構(gòu)的組織，在這些組織中，細胞會不停地復(fù)制分裂，然后形成一個一個的微球。這個微球會進一步發(fā)展，到第13天的時候，這些微球之間會發(fā)生連接并融合。長到30天的時候，組織內(nèi)部會形成一些典型結(jié)構(gòu)，一個就是支架完全被打印進去的肝臟細胞所替代，除了替代掉的之外，還有一些材料沒有降解掉的，在這部分材料中也有一些細胞團的存在。因為內(nèi)部出現(xiàn)了低氧的環(huán)境，所以組織里面自發(fā)地出現(xiàn)了非常多的類似血管的通道，保證了內(nèi)部養(yǎng)分的供應(yīng)。

通過激光共聚焦的方式，我們可以觀察內(nèi)部細胞的存活情況。從13天的數(shù)據(jù)來看，存活率是比較高的，而之后存活率也一直保持了一個比較高的狀態(tài)。

打印過程中的質(zhì)量控制

在培養(yǎng)出了具有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的組織以后，我們在研究功能的時候發(fā)現(xiàn)，功能的標(biāo)準偏差非常大。這到底是因為細胞功能、打印處理或者誘導(dǎo)的問題，還是本身結(jié)構(gòu)的問題呢？

結(jié)構(gòu)問題是我們在細胞表型后需要考慮的，因為水凝膠是非常軟的一種材料，在打印過程中，就有較大的形變。我們建立了一套復(fù)合合多種成像技術(shù)和處理算法的系統(tǒng)，對打印結(jié)構(gòu)進行一個深度檢測和分析。在整個過程中我們發(fā)現(xiàn)，其實打印過程已經(jīng)出現(xiàn)了非常多的問題，比如材料形變以及交聯(lián)過程中控制的不準確等。

在此基礎(chǔ)上，我們建立了一系列的算法，對材料的孔徑、連通率、表面積等因素做了定量化的分析。利用這些算法我們可以做一個質(zhì)控，使得打印的結(jié)構(gòu)更為精準地符合我們的設(shè)計。雖然生物本來就是非線性的，但是我們發(fā)現(xiàn)，對于結(jié)構(gòu)的控制是線性相關(guān)的，這意味著我們可以對整個過程進行精準的反饋控制。相比之下，如果沒有基于這套量化分析的算法，不做控制打印出來的結(jié)構(gòu)的差異性是非常大的，而結(jié)構(gòu)的不同直接帶來了細胞生物活性的不一樣。

檢測細胞增殖

在排除掉結(jié)構(gòu)以及增殖過程對結(jié)構(gòu)的破壞因素之后，我們對細胞的增殖情況做了檢測。

細胞的增殖開始有個快速的增長過程，接著會進入一個相對緩慢的增長過程。大概在17-22天以后，細胞增殖進入了一個相對平臺期，此時我們可以檢測它們的一些基本因素。比如白蛋白，而白蛋白的分泌在8周的時間里一直維持在一個比較平穩(wěn)的分泌水平。當(dāng)然，P450酶系、CYP3A4基因的表達等，也都是我們關(guān)注的點。

從整體上來看，跟平面培養(yǎng)的數(shù)據(jù)相比，3D打印之后的細胞內(nèi)一些P450酶系基因的表達不但沒有增加，反而開始降低了，特別是到2-3天的時候達到一個低值。在排除掉打印過程中壓力和剪切力等導(dǎo)致了細胞表型發(fā)生變化等這些因素后，我們發(fā)現(xiàn)主要的原因應(yīng)該是長時間平面培養(yǎng)的這些細胞在重新回到3D的環(huán)境下，本身就有一個適應(yīng)期。

藥物試驗

過了66個小時之后，細胞增殖的數(shù)量就開始上升，大概20天以后，我們用利福平這一典型的用來做肝損的陽性藥物的實驗。

我們設(shè)置了平面對照，發(fā)現(xiàn)差異非常大，不管這種差異是不是更接近于人體真實情況，差異的存在本身就意味著平面和3D之間存在區(qū)別，說明這個研究是有價值的。

比如說我們這里利福平它明顯地呈現(xiàn)對肝功能更為長時間的影響。首先是三維條件下CYP3A4的表達相比平面的表達時間更長。第二在利福平的作用下會有一些長期的毒性顯示出來。

圍繞利福平，我們又做了一系列的數(shù)據(jù)，包括從CYP2B6，MRP2，BSEP等一系列跟肝臟藥物代謝相關(guān)的基因表達，跟平面之間都存在顯著差異。還有苯巴比妥、奧美拉唑等幾個典型的陽性藥物，在這樣的模型中相比傳統(tǒng)的平面是有區(qū)別的。

在這個基礎(chǔ)上，我們嘗試開發(fā)高通量篩選技術(shù)。高通量篩選需要基于在線即時檢測的技術(shù)。我們建立了包含多個叉指電極陣列的芯片，它依靠的是細胞跟電極之間接觸的阻抗來在線檢測細胞的增殖、遷移和死亡情況。

打印之后有幾個問題要解決。這種電極的設(shè)計是針對培養(yǎng)在平面的細胞，而現(xiàn)在細胞跟材料混在一起，我們需要確認在這種情況下能否測到它的增殖和死亡情況。

我們做了一系列的測試，包括加不同的溶液，檢測頻率等條件，看它對細胞的信號的檢測有沒有影響。我們用傳統(tǒng)的Alamar bule實驗和細胞芯片的方式檢測過組織的增殖過程，在線性上是基本一致的。

腫瘤藥物篩選所希望的結(jié)果是，篩選出的藥物能夠最大程度殺死腫瘤細胞同時對正常細胞的損傷最小。我們把肝臟組織和和腫瘤組織打印在一塊芯片上，從陽性藥物檢測來看，這個模型可以進行精準篩選。

同時我們也發(fā)現(xiàn)，一些需要肝臟二次代謝物才有很強的抗腫瘤毒性的藥物，在這個模型中也能被篩選出來。

我們今后想做的一些工作是，比如通過集成將多種組織在一塊芯片上，然后加上肝臟看他們之間的反應(yīng)。

最后做一個總結(jié)，首先我覺得3D打印這個技術(shù)在個性化需求強烈的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價值，對于科學(xué)研究來說它是一個很好的工具。特別是這個工具可以有可控結(jié)構(gòu)的材料以及可以把細胞打印成特殊的結(jié)構(gòu)。無論為組織工程也好，藥物的精準化篩選、個性化給藥也好，都是提供了一種全新的可能,請關(guān)注南極熊3d打印網(wǎng)。


來源：火石創(chuàng)造
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