類(lèi)器官培養(yǎng)，微陣列3D生物打印技術(shù)AHM+1！

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類(lèi)器官通過(guò)提供類(lèi)似于體內(nèi)的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有可能徹底改變體外疾病建模。然而，由于繁瑣的類(lèi)器官分化過(guò)程和難以擴(kuò)大培養(yǎng)及質(zhì)量控制的困難，這種不斷創(chuàng)新和發(fā)展的技術(shù)仍然需要分析通量和可重復(fù)性，以實(shí)現(xiàn)化合物的高通量篩選（HTS）。由于缺乏與相對(duì)較大的類(lèi)器官兼容且易于使用的流體系統(tǒng)，將類(lèi)器官用于HTS受到進(jìn)一步挑戰(zhàn)。在這里，美國(guó)北德克薩斯大學(xué)Moo-Yeal Lee與辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心Takanori Takebe、 James M. Wells通過(guò)“微陣列三維（3D）生物打印”技術(shù)以及用于人體類(lèi)器官培養(yǎng)和分析相關(guān)柱和灌注板來(lái)克服這些挑戰(zhàn)。將高精度、高通量干細(xì)胞打印和封裝技術(shù)、柱板與互補(bǔ)的深孔板和灌注孔板相結(jié)合用于靜態(tài)和動(dòng)態(tài)類(lèi)器官培養(yǎng)。將水凝膠中的生物打印細(xì)胞和球狀體分化為肝和腸類(lèi)器官，用于原位功能分析。柱狀/灌注板與標(biāo)準(zhǔn)的384孔板和HTS設(shè)備兼容，因此在目前的藥物發(fā)現(xiàn)工作中易于采用。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“A Pillar and Perfusion Plate Platform for Robust Human Organoid Culture and Analysis”為題于2023年8月24日發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》。

圖1 微陣列3D生物打印技術(shù)及相關(guān)柱及灌注板平臺(tái)

由于開(kāi)發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)法滿(mǎn)足需求，本研究開(kāi)發(fā)了微陣列3D生物打印技術(shù)和相關(guān)的柱/灌注板。微陣列3D生物打印是一種微電磁閥驅(qū)動(dòng)、高精度的機(jī)器人細(xì)胞打印技術(shù)，可以以最小的人工干預(yù)快速、重復(fù)地創(chuàng)建人體類(lèi)器官（圖1）。

圖2 柱板和深孔板的組合用于靜態(tài)類(lèi)器官培養(yǎng)

一個(gè)384柱板包含384個(gè)柱，使用3D生物打印機(jī)或多通道移液管分配懸浮在水凝膠中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）（圖2）。柱間距4.5 mm，柱高11.6 mm的384柱板是通過(guò)注塑成型制成的（圖2A）�？组g距4.5 mm、寬3.5mm、深14.7 mm的384深孔板采用注塑制造（圖2B）。

圖3 將柱板和灌注孔板相結(jié)合進(jìn)行動(dòng)態(tài)類(lèi)器官培養(yǎng)

除了384柱板和384深孔板，36柱板和36灌注板都建立在傳統(tǒng)的384孔板上，用聚苯乙烯注射成型進(jìn)行動(dòng)態(tài)類(lèi)器官培養(yǎng)（圖3）。模擬36灌注板中夾有36柱板的灌注孔和儲(chǔ)層水位隨時(shí)間的變化，以避免溢流（圖3F）。在灌注孔的柱下發(fā)現(xiàn)高速分布，這可能導(dǎo)致柱下的高流體混合，并加速柱上的細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3G、I）。

圖4 柱板上的生物打印人肝臟類(lèi)器官（HLOs）

為了成功地將iPSCs分化為類(lèi)器官并證明其在柱/灌注板中的功能，選擇不同分化階段的iPSCs、仿生水凝膠和含有特定生長(zhǎng)因子和添加劑的生長(zhǎng)介質(zhì)是至關(guān)重要的。本研究證明了人肝類(lèi)器官（HLOs）和人腸類(lèi)器官（HIOs）分別從懸浮在柱板上的海藻酸鹽和基質(zhì)膠混合物中的前腸細(xì)胞和柱板上的中后腸細(xì)胞球體中的分化。從形態(tài)學(xué)上看，在柱板和24孔板上培養(yǎng)的HLOs與內(nèi)腔被間充質(zhì)細(xì)胞包圍的圓形上皮細(xì)胞層相似（圖4A、B）。成熟的HLOs大小為0.1~0.2mm；維甲酸（RA）處理后，維甲酸基質(zhì)膠（對(duì)照）的間充質(zhì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)，而海藻酸鹽和基質(zhì)膠混合物的間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)顯著減少（圖4C）。

圖5 柱板上靜態(tài)培養(yǎng)的HLOs功能

通過(guò)評(píng)估類(lèi)器官形態(tài)、白蛋白分泌和肝臟生物標(biāo)志物的免疫熒光染色比較冷凍前腸細(xì)胞在水凝膠打印在24孔板中分化的HLOs。白蛋白分泌數(shù)量在三個(gè)不同的條件下幾乎是相同的（圖5A）。在36柱板上生成HLOs后，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)到HLOs中肝細(xì)胞標(biāo)記物肝細(xì)胞核因子-4α（HNF4α）和上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖5B）。在柱板上培養(yǎng)的HLOs（圖5B中間）與在24孔板上培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)板中培養(yǎng)的表達(dá)沒(méi)有差異（圖5B為底部）。除了白蛋白的分泌外，通過(guò)測(cè)量36柱板上的膽汁酸攝入量，證明了HLOs的顯微解剖特征（圖5C）。

圖6 用化合物處理柱板上靜態(tài)培養(yǎng)的HLOs

通過(guò)將HLOs暴露于36灌注板中的脂肪酸72小時(shí)，成功地模擬脂肪性肝炎（圖6A-C）。通過(guò)BODIPY-based脂質(zhì)染色和圖像分析評(píng)估HLOs中脂質(zhì)積累的能力（圖6A）。進(jìn)一步的高倍共聚焦成像顯示，經(jīng)油酸處理后，HLOs的細(xì)胞質(zhì)中積累了脂質(zhì)滴（圖6B、C）。為了評(píng)估藥物誘導(dǎo)的肝損傷（DILI），將帶有HLOs的36柱板夾在含有萘法唑酮的36灌注板上孵育72小時(shí)（圖6D-F）。藥物暴露后，通過(guò)將36柱板分離并將其夾在一個(gè)含有鈣綠素AM和乙型二聚體-1的384深孔板上來(lái)測(cè)量HLOs活力（圖6E），柱子上的綠點(diǎn)和紅點(diǎn)分別代表活細(xì)胞和死細(xì)胞，萘法唑酮濃度的增加導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。使用細(xì)胞滴度-Glo®發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定萘法唑酮的劑量反應(yīng)曲線和半抑制濃度值，結(jié)果顯示細(xì)胞活力以萘法唑酮的劑量依賴(lài)性方式下降（圖6F）。

圖7 通過(guò)將單個(gè)中后腸細(xì)胞球狀體從超低附著體（ULA）384孔板轉(zhuǎn)移到384柱板上，人腸類(lèi)器官（HIOs）在柱板上均勻分化

中后腸細(xì)胞球狀體在40天的過(guò)程中分化為HIOs（圖7A）。HIO在柱板上分化成熟40天后，在柱板上建立類(lèi)器官原位成像，顯示腸上皮發(fā)育和細(xì)胞-細(xì)胞緊密連接形成（圖7B、C）。在靜態(tài)培養(yǎng)中，正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HIOs分泌非常一致，且具有高度重復(fù)性（圖7D）。而HIOs在36柱板上培養(yǎng)4周后，柱板上8 ~14 %的HIOs因蛋白酶分泌的基質(zhì)凝膠降解而分離，5~11 %的中后腸聚集物由于細(xì)胞數(shù)量少而沒(méi)有正常分化為HIOs（圖7E）。即使當(dāng)附著在柱板上的HIOs的CV值低于25%時(shí)，也能實(shí)現(xiàn)均勻生長(zhǎng)（圖7D、F)。為了研究HIOs是否對(duì)像人類(lèi)腸道一樣的營(yíng)養(yǎng)水平有反應(yīng)，使用36柱板/36灌注板系統(tǒng)來(lái)動(dòng)態(tài)控制柱上葡萄糖水平，從3mM（禁食）到20mM（喂養(yǎng)）（圖7G）。這些結(jié)果表明，可以通過(guò)將球狀體轉(zhuǎn)移到柱板上，并通過(guò)原位成像或使用簡(jiǎn)單的流體方式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)類(lèi)器官，從而可擴(kuò)展地生成均勻類(lèi)器官。

綜上，本研究通過(guò)聚苯乙烯注射成型成功制造柱/灌注板，并通過(guò)功能分析演示靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的HLO和HIO培養(yǎng)。柱/灌注板通過(guò)支持深孔板中生長(zhǎng)介質(zhì)的靜態(tài)培養(yǎng)或生長(zhǎng)介質(zhì)通過(guò)灌注孔板的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)維持生物打印單細(xì)胞懸浮在海藻酸鹽和基質(zhì)凝膠的混合物中，以及基質(zhì)凝膠中的細(xì)胞球體的長(zhǎng)期類(lèi)器官培養(yǎng)。開(kāi)發(fā)的細(xì)胞打印和封裝方案具有高度的靈活性，允許在柱板上的基質(zhì)凝膠中培養(yǎng)多種類(lèi)器官，從而為化合物潛在的器官特異性毒性提供了更多的見(jiàn)解。本研究在柱/灌注板上展示的微陣列3D生物打印技術(shù)代表了一種獨(dú)特的策略，即快速地在仿生水凝膠中打印PSCs和類(lèi)器官。柱/灌注板平臺(tái)上的類(lèi)器官可以通過(guò)模擬體內(nèi)微環(huán)境再現(xiàn)組織發(fā)育并維持高組織功能。此外，可以通過(guò)高通量、高含量的類(lèi)器官分析在體外進(jìn)行復(fù)制和闡明化合物的組織功能和機(jī)制作用。將生物打印的類(lèi)器官與高含量的全類(lèi)器官成像相結(jié)合，以更好地了解生成的類(lèi)器官的功能和化合物的細(xì)胞毒性。因此，微陣列生物3D打印技術(shù)可以解決類(lèi)器官研究中未滿(mǎn)足的需求，通過(guò)結(jié)合柱板上PSCs的快速打印，在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中分化和成熟為類(lèi)器官，模擬人體組織的生理微環(huán)境，同時(shí)顯著提高吞吐量和可操作性，以預(yù)測(cè)化合物的篩選。本研究設(shè)想在柱/灌注板中生物打印的類(lèi)器官可以為化合物的臨床前評(píng)估或優(yōu)先考慮環(huán)境毒物提供高度預(yù)測(cè)的毒性和有效性信息。因此，本研究中獨(dú)特的方法可以為HTS的類(lèi)器官檢測(cè)提供廣泛的工業(yè)應(yīng)用。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202302502