清華大學(xué)熊卓團(tuán)隊(duì)：3D打印具有高細(xì)胞密度和異質(zhì)微環(huán)境的血管化肝組織

來源：EngineeringForLife

3D擠出生物打印由于其精確沉積細(xì)胞和生物相容性材料（即生物墨水）的強(qiáng)大能力，已廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)。理想的生物墨水應(yīng)具有良好的可打印性，以產(chǎn)生組織形狀的結(jié)構(gòu)，同時(shí)屏蔽封裝細(xì)胞在生物打印過程中免受有害暴露。然而，目前仍然缺乏具有高細(xì)胞密度和可打印性的生物墨水極大地限制了打印功能組織的能力。

針對此問題，來自清華大學(xué)的熊卓課題組開發(fā)了一種基于密集細(xì)胞聚集體的顆粒細(xì)胞聚集體雙相（GCAB）生物墨水來解決這一限制。GCAB生物墨水表現(xiàn)出擠出生物打印所需的剪切稀化和剪切恢復(fù)特性以及打印后的超彈性行為，用于模擬軟生物組織的機(jī)械特性（圖1）。通過在定義的異質(zhì)微環(huán)境中預(yù)組織GCAB生物墨水，打印出具有增強(qiáng)血管化和代謝功能的致密肝組織結(jié)構(gòu)（圖1）。這種通用GCAB生物墨水的設(shè)計(jì)為創(chuàng)建用于治療應(yīng)用的功能組織開辟了新途徑。

相關(guān)論文以“3D printing of vascularized hepatic tissues with a high cell density and heterogeneous microenvironment”為題于2023年7月20日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 GCAB生物墨水示意圖

1. 具有生理密度的通用生物墨水
為了在生物3D打印中用作生物鏈接，需要大量產(chǎn)生大小和形狀一致的細(xì)胞聚集體。在這項(xiàng)研究中，作者使用HepG2球體作為樣本，因?yàn)镠epG2是一種癌細(xì)胞系，已被廣泛用作研究肝功能的模型細(xì)胞。為此，使用由10000個(gè)微孔組成的PDMS微孔板以高通量產(chǎn)生球狀體（圖2a-b）。HepG2球體在24小時(shí)內(nèi)自組裝，這是因?yàn)榧?xì)胞間相互作用明顯高于細(xì)胞-基質(zhì)相互作用（圖2c-e）�；�/死分析證實(shí)大多數(shù)HepG2球狀體仍然為存活狀態(tài)（圖2f）。

然后，作者通過在GelMA水凝膠內(nèi)密集堆積GFP-HepG2球體來制備GCAB生物墨水。GFP-HepG2球體用于可視化它們在打印絲內(nèi)的密集分布（圖2i）。作者還成功打印了清華大學(xué)的標(biāo)志“THU”（圖2j），通過將打印的結(jié)構(gòu)分解成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞密度量化為~1.7×108個(gè)細(xì)胞，同時(shí)在第7天觀察到細(xì)胞遷移和球體融合（即多個(gè)球體的直接聚集）。SEM圖像證實(shí)了GCAB生物墨水的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，其中球體緊密堆積并被周圍的水凝膠基質(zhì)分隔開（圖2k）。同樣，作者生成了直徑為115±10 μm、圓度為0.87±0.04的人類間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)球體（圖2l）。

圖2 開發(fā)顆粒狀聚集體作為具有生理密度的通用生物墨水

2. GCAB生物墨水的3D打印和機(jī)械表征
生物墨水的流變特性對于擠出生物打印至關(guān)重要。為了評估聚集體形態(tài)對流變特性的影響，作者將GCAB生物墨水與傳統(tǒng)的無細(xì)胞(CF)和DCL GelMA水凝膠生物墨水的流變特性進(jìn)行了比較。所有生物墨水都顯示出必要的剪切稀化（圖3a）、屈服應(yīng)力（圖3b）和自我修復(fù)（圖3c）特性，并具有快速愈合動(dòng)態(tài)打印后，從而保護(hù)細(xì)胞免受高剪力墻應(yīng)力，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。GCAB生物墨水由于其堵塞性質(zhì)而變得不太對溫度敏感（圖3d），這表明擠出生物打印的溫度窗口延長。隨后，作者優(yōu)化了打印參數(shù)，成功打印了高保真雙環(huán)（圖3e）和晶格結(jié)構(gòu)（圖3f），表達(dá)GFP的球體用于確認(rèn)GCAB生物墨水的顆粒形態(tài)和相鄰層之間的互連性。GCAB生物墨水表現(xiàn)出與傳統(tǒng)DCL生物墨水相當(dāng)?shù)挠∷⑦m性（圖3g）。

圖3 GCAB生物墨水的3D打印和機(jī)械表征

擠出和自由基聚合過程中的剪切力對細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響。存活的球體在培養(yǎng)過程中繼續(xù)生長（圖3k）。GCAB生物墨水表現(xiàn)出比DCL生物墨水更快的增殖速率（圖3l）。此外，使用GCAB墨水打印的結(jié)構(gòu)可以承受約50%的應(yīng)變并彈性恢復(fù)數(shù)百次，從而驗(yàn)證了其出色的循環(huán)壓縮性能（圖3o）。

3. 異質(zhì)微環(huán)境增強(qiáng)血管化和肝功能
基于以上結(jié)果，作者使用GCAB生物墨水創(chuàng)建高細(xì)胞密度的器官特異性組織。通過結(jié)合懸浮浴將GCAB生物墨水打印到人體解剖結(jié)構(gòu)中。作者成功打印了肝臟模型（圖4b）、螺旋圖案（圖4c）和包含懸垂物和空腔的開放室（圖4d）。打印結(jié)構(gòu)和3D模型的配準(zhǔn)證實(shí)了高形狀保真度。接著，作者通過將HUVEC納入GCAB生物墨水的水凝膠相來重現(xiàn)肝臟致密且異質(zhì)的細(xì)胞微環(huán)境。GCAB生物墨水組中的GFPHUVEC主要局限于球狀體間區(qū)域（圖4e-f），而DCL生物墨水組中的HUVEC與RFPHepG2細(xì)胞均勻混合（圖4g-h）。

在水凝膠的血管形態(tài)發(fā)生過程中，封裝的HUVEC通過整合素與基質(zhì)相互作用，形成空隙空間（即液泡），這些空隙空間在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間結(jié)合形成管腔。一些較大的液泡已經(jīng)合并，在細(xì)胞內(nèi)形成大型的管腔結(jié)構(gòu)。毛細(xì)管狀結(jié)構(gòu)可以維持至少7天（圖4i-j）。VEcadherin免疫染色進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，這對于內(nèi)皮細(xì)胞接觸完整性至關(guān)重要（圖4m-n）。這些發(fā)現(xiàn)表明，GCAB生物墨水為體外細(xì)胞介導(dǎo)的含腔毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的形成提供了更寬松的環(huán)境。

圖4 異質(zhì)微環(huán)境增強(qiáng)血管化和肝功能

4. 具有可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的功能性肝組織的3D打印
在這項(xiàng)研究中，作者嘗試同時(shí)制造具有高細(xì)胞密度和可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的3D厚組織結(jié)構(gòu)。由于GCAB生物墨水太弱，無法支持包含空隙或通道的打印結(jié)構(gòu)，因此打印了短效墨水作為模板來生成血管網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)支持GCAB生物墨水的打印（圖5a）。為了提高HUVEC的接種效率和均勻性，使用了原位內(nèi)皮化策略，將內(nèi)皮細(xì)胞封裝在犧牲明膠生物墨水內(nèi)。熒光顯微鏡所示，有許多內(nèi)皮細(xì)胞附著在通道表面。SEM圖像證實(shí)了GFP-HUVEC在第1天的均勻分布（圖5e），表明原位內(nèi)皮化方法具有較高的接種效率。第3天（圖5f-g），細(xì)胞增殖形成匯合的內(nèi)皮層。此外，還在第7天觀察到可灌注血管網(wǎng)絡(luò)侵入由GCAB生物墨水組成的周圍組織（圖5h-i)）。由此可見，通過將GCAB生物墨水與先進(jìn)的生物打印策略相結(jié)合，可以制造具有接近生理細(xì)胞密度、脈管系統(tǒng)和功能的個(gè)性化器官特異性組織，用于治療目的。

圖5 具有可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的功能性肝組織的3D打印

綜上，本文引入了基于顆粒細(xì)胞聚集體的雙相（GCAB）生物墨水的概念，作為擴(kuò)展擠出生物打印生物墨水庫的通用策略。這種方法提供了優(yōu)良的生物打印能力，具有高細(xì)胞密度、良好的活力和超彈性行為，還打印了具有異質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的血管化肝組織結(jié)構(gòu)，由于更緊密的細(xì)胞間相互作用而加速了血管化和組織重塑。此外，通過與犧牲打印策略相結(jié)合，生產(chǎn)了具有可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的功能性致密肝組織結(jié)構(gòu)，以滿足其代謝需求。先進(jìn)的生物打印策略與GCAB生物墨水的自組織特性的融合，將為創(chuàng)建用于治療應(yīng)用的功能性組織和器官開辟新途徑。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ace5e0