華中科技大學(xué)材料學(xué)院張祥林、吳斌課題組關(guān)于冷凍3D打印系列研究

來源: EngineeringForLife

冷凍3D打印/低溫沉積制造是將低溫場(chǎng)引入傳統(tǒng)的擠出沉積成型、靜電紡絲等3D打印技術(shù)形成的一種新型3D打印方法。低溫可以使打印漿料在三維支架成型的過程中發(fā)生相分離，原本均勻漿料中的溶劑會(huì)結(jié)晶析出；在后續(xù)的處理過程中將溶劑結(jié)晶升華可留下微米級(jí)孔洞。如此，可制備具有大孔（100 μm級(jí)別）和微孔（1 μm級(jí)別）的多級(jí)孔三維支架，其多級(jí)孔結(jié)構(gòu)能模擬天然組織的結(jié)構(gòu)形貌、提供供養(yǎng)通道、增加載藥能力和礦化面積等，使得多級(jí)孔支架相較于單級(jí)孔支架有更多優(yōu)勢(shì)。而且低溫沉積制造技術(shù)可用的生物材料范圍廣泛，低溫場(chǎng)對(duì)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞較為友好，這些優(yōu)點(diǎn)使得低溫沉積制造技術(shù)在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域很有應(yīng)用前景。

華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張祥林、吳斌課題組自2019年至今針對(duì)冷凍3D打印/低溫沉積制造進(jìn)行了系列研究，與華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院合作，在Chemical Engineering Journal (2), Bioactive Materials (1), Biofabrication (2) 和Materials & Design (2)等期刊上共發(fā)表了7篇文章，簡(jiǎn)介如下：

1. 冷凍靜電紡絲方法制備的用于胃腸道黏膜修復(fù)的仿生雙面膜

大面積的胃腸道黏膜缺損難以修復(fù)，致死率高�，F(xiàn)有的人工黏膜制備研究忽視了天然黏膜的褶皺結(jié)構(gòu)與上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的旁分泌作用這兩個(gè)特征，導(dǎo)致黏膜修復(fù)不充分。受天然黏膜解剖結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，本文通過冷凍靜電紡絲技術(shù)制備了一種具有仿生結(jié)構(gòu)的雙面電紡膜。首先，冷凍電紡膜的結(jié)構(gòu)與天然消化道黏膜類似，外表面具有褶皺結(jié)構(gòu)，內(nèi)表面平整。褶皺結(jié)構(gòu)和冷凍電紡絲上的微米孔促進(jìn)了上皮細(xì)胞的增殖。其次，本研究在雙面膜的外表面和內(nèi)表面上分別培養(yǎng)了上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以模擬天然消化道黏膜層的細(xì)胞組成。雙面膜在隔離這兩種細(xì)胞直接接觸的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞間的旁分泌作用：成纖維細(xì)胞分泌的EGF可以通過雙面膜，刺激另一面的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄更多的c-Myc和Mcl-1，進(jìn)而在增加上皮細(xì)胞的再生和抗菌能力�？偨Y(jié)，本文提出的冷凍靜電紡絲雙面膜實(shí)現(xiàn)了對(duì)天然胃腸道黏膜的褶皺結(jié)構(gòu)和旁分泌作用這兩大特點(diǎn)的仿生，為消化道黏膜的大面積缺損提供了一種很有潛力的修復(fù)方案。

圖1 冷凍電紡雙面膜模擬天然消化道黏膜的褶皺結(jié)構(gòu)及旁分泌作用

圖2 a）天然小鼠食道黏膜中的上皮層（E）和固有層（L）的雙層結(jié)構(gòu)

圖3 雙面膜的表面形貌：a）粗糙面；b）平整面

圖4 上皮細(xì)胞細(xì)胞核朝向的分布統(tǒng)計(jì)：a）粗糙面；b）平整面

相關(guān)研究成果以“Biomimetic Janus film fabricated via cryogenic electrospinning for gastrointestinal mucosa repair”為題于2023年3月20日發(fā)表在《Materials & Design》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的吳斌博士、講師，和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科白濤副教授、副主治醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2023.111839

2. 低溫沉積制造的脫細(xì)胞基質(zhì)支架用于雙生長(zhǎng)因子次序釋放以促進(jìn)原位骨再生

原位組織工程是治療骨缺損的一種強(qiáng)有力的策略，它是指不需要在支架上預(yù)負(fù)載細(xì)胞，而是通過支架本身的結(jié)構(gòu)和材料創(chuàng)造一個(gè)類似天然骨的微環(huán)境，吸引人體內(nèi)干細(xì)胞歸巢，在支架處原位修復(fù)骨缺損的方法。它可以避免傳統(tǒng)的骨組織工程支架所需的細(xì)胞擴(kuò)增步驟、低細(xì)胞存活率及免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。本文通過低溫沉積制造技術(shù)制備了聚己內(nèi)酯（PCL）/小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（dSIS）雙材料多孔支架，隨后在支架中負(fù)載了兩種活性生長(zhǎng)因子（適配體（Apt19s）和PlGF-2123-144*融合的BMP2（pBMP2））進(jìn)行表面修飾。兩種生物活性分子與支架中dSIS的親和力強(qiáng)弱不同，因此可按次序相繼釋放。首先，適配體Apt19s快速釋放，它對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）表現(xiàn)出結(jié)合親和力，可將干細(xì)胞吸引至支架上，完成歸巢。其次，pBMP2緩慢釋放，可促進(jìn)已歸巢的干細(xì)胞發(fā)生成骨分化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫沉積制造多孔支架的雙生長(zhǎng)因子次序釋放促進(jìn)了細(xì)胞遷移、增殖、堿性磷酸酶活性，以及成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。體內(nèi)結(jié)果表明了這一釋放系統(tǒng)顯著增加大鼠顱骨臨界尺寸缺損的骨修復(fù)。因此，本文證明了低溫沉積制造多孔支架作為新型藥物釋放平臺(tái)所顯示的實(shí)現(xiàn)無細(xì)胞原位骨再生策略的潛力。

圖5 低溫沉積制造的PCL/dSIS支架及其促進(jìn)原位骨再生的能力

相關(guān)研究成果以“In situ bone regeneration with sequential delivery of aptamer and BMP2 from an ECM-based scaffold fabricated by cryogenic free-form extrusion”為題于2021年4月發(fā)表在《Bioactive Materials》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的吳斌博士、講師，和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的郭曉東教授、主任醫(yī)師，第一作者為孫亭方博士、主治醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.04.013

3. 低溫沉積制造的載外泌體支架用于糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)

盡管治療策略不斷改進(jìn)，糖尿病創(chuàng)面的愈合仍然是一個(gè)世界級(jí)難題，這是由于高血糖導(dǎo)致的血管功能障礙會(huì)導(dǎo)致血供不足、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，造成創(chuàng)面久久不愈。本文利用低溫沉積制造技術(shù)制備了豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（dSIS）支架，將其與介孔生物玻璃（MBG）以及外泌體相結(jié)合，構(gòu)建了3D支架敷料（dSIS/MBG@Exos)，使得外泌體的持續(xù)性釋放成為可能。dSIS/MBG@Exos水凝膠支架具有良好的多孔性、生物相容性和止血能力，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的血管生成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明dSIS/MBG@Exos水凝膠支架可增加糖尿病創(chuàng)面的血管生成和血流。dSIS/MBG@Exos水凝膠支架還能促進(jìn)肉芽組織的形成和膠原纖維的沉積，這些因素都有利于促進(jìn)創(chuàng)面愈合�？傊�，這項(xiàng)研究提出了有潛力的治療糖尿病創(chuàng)面的新策略。

圖6 低溫沉積制造的載外泌體支架用于糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)

相關(guān)研究成果以“Cryogenic 3D Printed Hydrogel Scaffolds Loading Exosomes Accelerate Diabetic Wound Healing”為題于2021年11月發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上。通訊作者為華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的劉國(guó)輝教授、主任醫(yī)師、熊蠡茗教授、主任醫(yī)師和米博斌博士、主治醫(yī)師，第一作者為協(xié)和骨科的胡益強(qiáng)博士、主治醫(yī)師和華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的吳斌博士、講師。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.130634

4. 低溫沉積制造含小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)和Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石的骨組織工程支架

新型的骨生物材料最好能夠模擬天然骨的結(jié)構(gòu)和組成，并具有足夠的生物多功能性以按時(shí)間順序促進(jìn)骨再生。本文通過低溫沉積制造技術(shù)制備了由小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（SIS-ECM）和Sr2+/Fe3+共摻雜的納米羥基磷灰石（SrFeHA）組成的新型仿生支架。這種SIS/SrFeHA支架表現(xiàn)出了理想的互連三維大孔/微孔結(jié)構(gòu)、粗糙微表面和增強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)具有協(xié)同釋放的生物活性ECM和Sr2+/Fe3+離子。這些良好的物理化學(xué)性質(zhì)使得SIS/SrFeHA復(fù)合支架能產(chǎn)生高度仿生的骨骼微環(huán)境，可通過免疫調(diào)節(jié)來增強(qiáng)血管生成、成骨和生物礦化。體內(nèi)的顱骨缺損和皮下植入實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了SIS/SrFeHA支架在刺激早期免疫反應(yīng)、新生血管形成和體內(nèi)骨再生等方面的優(yōu)越能力，表明SIS和SrFeHA的混合能加速骨愈合過程。此外，通過RNA測(cè)序分析證明了SIS/SrFeHA復(fù)合支架能上調(diào)Amot+/YAP-/Hippo信號(hào)通路以促進(jìn)血管生成。因此，本文表明了SIS/SrFeHA復(fù)合支架誘導(dǎo)骨愈合的潛力，同時(shí)更好地闡述了活性SrFeHA成分的潛在機(jī)制，從而可能提供了一種新的有前景的未來骨組織工程植入物。

圖7 低溫沉積制造含小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)和Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石的骨組織工程支架

相關(guān)研究成果以“Cryogenically 3D printed biomimetic scaffolds containing decellularized small intestinal submucosa and Sr2+/Fe3+ co-substituted hydroxyapatite for bone tissue engineering”為題于2021年11月發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張祥林教授，和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的郭曉東教授、主任醫(yī)師，第一作者為楊亮博士。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.133459

5. 低溫沉積制造的多孔Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石骨組織工程支架

開發(fā)具有生物多功能的多摻雜生物陶瓷對(duì)骨組織工程很有吸引力和前景。據(jù)此，本課題組此前已設(shè)計(jì)了摻雜濃度固定在10 mol%的系列梯度Sr2+/Fe3+共摻雜納米羥基磷灰石（SrFeHA）。為評(píng)估其促進(jìn)骨愈合的潛力，本文將其與聚已內(nèi)酯（PCL）混合，通過低溫沉積制造技術(shù)制備了新型的梯度SrFeHA/PCL支架。制備的支架展示出了良好的三維互連多孔結(jié)構(gòu)和粗糙微表面，以及具有生物活性的Sr2+/Fe3+。這些有利的物理化學(xué)性質(zhì)使支架實(shí)現(xiàn)了體外和體內(nèi)的有效生物應(yīng)用，特別是中度共摻雜的Sr7.5Fe2.5HA支架和Sr5Fe5HA支架表現(xiàn)出了顯著增強(qiáng)的生物活性，不僅直接促進(jìn)了MC3T3成骨細(xì)胞和HUVECs的功能，而且還可以刺激巨噬細(xì)胞活化，同時(shí)促進(jìn)成骨/血管生成。此外，體內(nèi)皮下植入和顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了它們通過釋放Sr2+/Fe3+引發(fā)免疫反應(yīng)、促進(jìn)植入物血管化和原位骨再生的優(yōu)越能力。綜上，本文展示了Sr7.5Fe2.5HA和Sr5Fe5HA復(fù)合支架通過偶聯(lián)血管生成/成骨和免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)了骨再生進(jìn)程，因此可能提供了一種新的骨組織工程植入物。

圖8 低溫沉積制造的多孔Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石的骨組織工程支架

相關(guān)研究成果以“Bioactive Sr2+/Fe3+ co-substituted hydroxyapatite in cryogenically 3D printed porous scaffolds for bone tissue engineering”為題于2021年4月發(fā)表在《Biofabrication》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張祥林教授，和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的郭曉東教授、主任醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/abcf8d

6. 低溫沉積制造的多孔聚已內(nèi)酯組織工程支架

本文基于低溫沉積制造（-20℃）和后續(xù)的冷凍干燥制備了高孔隙率、高保真度的聚己內(nèi)酯（PCL）支架。冷凍干燥在一定程度上導(dǎo)致支架沿X、Y和Z軸收縮。CP600，CP800和CP1000三種支架的孔隙率分別為64.0±1.2%、70.1±1.3%和74.3±0.6%。本文對(duì)低溫沉積制造（ECP）的支架進(jìn)行了多種結(jié)構(gòu)特征表征，并將之與通過傳統(tǒng)熔融3D打�。‥MP）制備的支架進(jìn)行了比較。ECP支架中PCL的結(jié)晶度（57.1±2.2%）低于EMP支架（69.8±1.3%）。ECP支架表現(xiàn)出了更高降解性和較低的抗壓性能。此外，ECP支架促進(jìn)了MCT3T-E1細(xì)胞的黏附和增殖，并使其表現(xiàn)出了良好的舒展形態(tài)�？傊�，本文證明了低溫沉積制造的PCL支架具有潛在的組織工程應(yīng)用。

圖9 低溫沉積制造的多孔聚已內(nèi)酯組織工程支架

相關(guān)研究成果以“Fabrication and characterization of porous polycaprolactone scaffold via extrusion-based cryogenic 3D printing for tissue engineering”為題于2019年6月發(fā)表在《Materials & Design》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張祥林教授和李文超博士（現(xiàn)為南昌大學(xué)先進(jìn)制造學(xué)院講師）。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2019.107946

7. 低溫沉積自由成形小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架在皮膚組織工程中的潛在應(yīng)用

本文提出了一種低溫沉積自由成形的3D打印策略，用以打印小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（dSIS）多孔支架。dSIS的流變性能包括動(dòng)力粘度、儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G〃）等均適用于擠出成型。本文制備了三組不同的支架：P500、P600和P700，它們的絲間距（多孔支架中相鄰兩根纖維間的距離）分別為500、600和700 μm。打印參數(shù)包括：5mm/s的平臺(tái)工作速度（Vxy）、25 kPa的擠出壓力（P）和-20 ℃的制造溫度。支架尺寸在制備過程中會(huì)發(fā)生變化，因此，本文對(duì)冷凍打印支架的初始狀態(tài)、冷凍干燥后的狀態(tài)和使用模擬體液（PBS）清洗后的狀態(tài)進(jìn)行了比較；并且比較了P500、P600和 P700支架的楊氏模量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞在支架表面和內(nèi)部生長(zhǎng)良好，細(xì)胞的黏附程度、活性和增殖率均得到了增加。此外，體外基因和蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果表明dSIS支架可以促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞分泌一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（即I型膠原、III型膠原和纖連蛋白）。綜上，本文提出了一種新策略，通過結(jié)合低溫沉積制造技術(shù)和脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)材料制備了理想的皮膚組織工程支架。


相關(guān)研究成果以“Cryogenic free-form extrusion bioprinting of decellularized small intestinal submucosa for potential applications in skin tissue engineering”為題于2019年5月發(fā)表在《Biofabrication》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張祥林教授，和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的熊蠡茗教授、主任醫(yī)師，第一作者為石磊博士和協(xié)和骨科的胡益強(qiáng)博士、主治醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab15a9