清華大學(xué)熊卓課題組AM：SPIRIT逐級(jí)懸浮打印技術(shù)，讓3D打印復(fù)雜器官有形更有“魂”！

來源：清華大學(xué)熊卓課題組

組織/器官的體外功能化重建是生物制造領(lǐng)域長期以來的努力目標(biāo)；然而，組織器官的外部復(fù)雜結(jié)構(gòu)和內(nèi)部精細(xì)特征（如血管等）的耦合構(gòu)建仍極具挑戰(zhàn)。為解決該難題，清華大學(xué)熊卓、張婷課題組（BRE團(tuán)隊(duì)）提出了一種逐級(jí)懸浮3D打印技術(shù)（Sequential Printing in a Reversible Ink Template, 簡稱SPIRIT），相關(guān)成果近期以“Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks”為題發(fā)表在材料領(lǐng)域頂刊Advanced Materials（IF = 32.086）上。利用前期工作中開發(fā)的兼具剪切稀化和自愈合特性的微凝膠雙相（MB）生物墨水，SPIRIT技術(shù)通過將MB生物墨水在多級(jí)打印階段分別用作可打印墨水和懸浮介質(zhì)，成功構(gòu)建了含可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的心室模型，這是現(xiàn)有生物3D打印技術(shù)所無法實(shí)現(xiàn)的。SPIRIT技術(shù)有效拓展了常規(guī)擠出3D打印的技術(shù)邊界，能夠?qū)崿F(xiàn)具有復(fù)雜宏觀結(jié)構(gòu)和精細(xì)血管的組織器官快速構(gòu)建，有望加速工程化組織器官在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

本文第一作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心方永聰助理研究員，通訊作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心副主任熊卓副教授。清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心主任孫偉教授、張婷副研究員及碩士生郭依涵、博士生吳炳炎等共同參與了本研究工作。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(U21A20394)，清華大學(xué)人才引進(jìn)啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)基金(53330200321)，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFA0703004）和中國博士后科學(xué)基金站前資助 (2021TQ0184)等項(xiàng)目支持。

背景介紹
組織/器官的體外功能化重建是生物制造領(lǐng)域的難題之一，而生物3D打印技術(shù)憑借精確地逐層堆積生物材料的能力，引起了人們的極大興趣�？紤]到水凝膠的力學(xué)性能較差，懸浮生物3D打印技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注。簡單來說，懸浮介質(zhì)具有獨(dú)特的剪切稀化和自愈特性，在屈服應(yīng)力下呈流態(tài)，在無應(yīng)力下呈固態(tài)，能夠支撐生物墨水的自由成形，而懸浮介質(zhì)可以通過清洗或升溫的方式被去除。例如，卡耐基梅隆大學(xué)的研究人員開發(fā)一種FRESH技術(shù)，可以將一個(gè)全尺寸的人類心臟模型懸浮打印到明膠微粒介質(zhì)中。除了外部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性外，構(gòu)建功能化組織/器官的另一個(gè)障礙是缺乏分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)，限制了氧和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞。犧牲模板技術(shù)和多材料打印技術(shù)被廣泛應(yīng)用于在組織結(jié)構(gòu)中構(gòu)建復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)，近年來，懸浮生物3D打印同樣被用來打印具有更高仿生度的血管網(wǎng)絡(luò)。具體來說，將犧牲性墨水懸浮打印至負(fù)載細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，打印后將犧牲墨水溶出得到中空通道。例如，哈佛大學(xué)研究人員提出的SWIFT技術(shù)通過，通過將明膠犧牲墨水懸浮打印至類器官懸浮介質(zhì)中，去除明膠后得到可灌注的血管網(wǎng)絡(luò)�？偨Y(jié)而言，F(xiàn)RESH技術(shù)能夠構(gòu)建復(fù)雜外形，但很難成型血管網(wǎng)絡(luò)等內(nèi)部結(jié)構(gòu)；SWIFT技術(shù)能夠構(gòu)建具有接近生理細(xì)胞密度的血管化組織，然而組織形狀在很大程度上受到容器的限制，很難復(fù)現(xiàn)天然組織和器官的外部結(jié)構(gòu)。

因此，亟需開發(fā)一種新的3D打印工藝，以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組織器官的外部幾何特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的耦合成形。為實(shí)現(xiàn)該目的，BRE團(tuán)隊(duì)提出了逐級(jí)懸浮生物3D打印技術(shù)（稱為SPIRIT技術(shù)），至少包括i）在懸浮介質(zhì)中打印生物墨水，得到組織和器官的復(fù)雜外部結(jié)構(gòu)；iii）將犧牲墨水打印到初次打印但未交聯(lián)的結(jié)構(gòu)中，獲得自由形態(tài)的血管網(wǎng)絡(luò)；iii）原位交聯(lián)，去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水等步驟。SPIRIT技術(shù)的關(guān)鍵在于使用一種能夠同時(shí)作為打印墨水和懸浮介質(zhì)的生物材料，該團(tuán)隊(duì)采用了前期工作開發(fā)的載細(xì)胞微凝膠雙相生物墨水，其在較寬的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的剪切稀化、自愈合以及快速原位光交聯(lián)能力，適合于SPIRIT打印技術(shù)。

圖1 逐級(jí)懸浮生物3D打印策略

1.MB生物墨水的表征和打印
MB生物墨水由微凝膠和水凝膠前驅(qū)體組成，通過微流控法來制備（圖2a），變異系數(shù)小于2.5%（圖2b）。通過流道設(shè)計(jì)和流速調(diào)節(jié)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)微凝膠幾何形狀和大小的控制（圖2c）。MB生物墨水表現(xiàn)出優(yōu)異的打印性能，能夠打印成各種結(jié)構(gòu)（圖2d-e）。負(fù)載hiPSCs的明膠/海藻酸鹽微凝膠通過鈣離子和微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺（mTG）酶進(jìn)行雙交聯(lián)，交聯(lián)后的細(xì)胞活性處于中等水平（圖2f）。將微凝膠與相同的水凝膠前驅(qū)體混合，得到MB生物墨水（圖2g）。打印和交聯(lián)后，hiPSCs的活力略有下降（圖2h），表明打印過程對(duì)細(xì)胞活力有一定影響。在培養(yǎng)期間，hiPSCs繼續(xù)增殖，并傾向于以胚狀體（EB）的形式生長（圖2i）。胚狀體的直徑隨培養(yǎng)時(shí)間而增大（圖2j），表明其具有較快的增殖速度（圖2k）。第8天免疫熒光染色（圖2l）和流式分析（圖2m）證實(shí)hiPSCs能夠保持較好的全能性（>80%）。在加入心肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基后，hiPSCs開始向心肌細(xì)胞分化（圖2n）。在分化14天后，觀察到跳動(dòng)的心臟類器官（圖2o），證明載hiPSCs MB生物墨水可以通過原位增殖和分化來形成特定組織器官。

圖2 載細(xì)胞MB生物墨水的表征和生物3D打印

2.生物墨水的懸浮打印構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)體
以鋸齒形結(jié)構(gòu)為例（圖3a）進(jìn)行懸浮打印工藝參數(shù)的優(yōu)化，為定量比較打印結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)模型之間的差異，使用結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（SSIM）來評(píng)估溫度對(duì)打印精度的影響。首先，將打印結(jié)構(gòu)的圖像轉(zhuǎn)換為二值圖像，進(jìn)行閾值分割，以確定平均絲寬和SSIM（圖3b）。結(jié)果顯示，提高打印溫度會(huì)導(dǎo)致細(xì)絲加寬，在24 ℃時(shí)SSIM最高（圖3c-d）。通過在恒定的打印速度下控制擠出速度，可以實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)打印微絲的直徑（圖3e）。在Carbopol懸浮介質(zhì)中打印了完整的心臟模型（圖3f-g）、開放腔室（圖3h-i）和支氣管模型（圖3j-k）。通過定量評(píng)估管狀結(jié)構(gòu)的形狀保真度，進(jìn)一步比較了直接打印和懸浮打印的打印精度（圖3l-m）。光交聯(lián)后將Carbopol懸浮介質(zhì)去除，懸浮打印結(jié)構(gòu)的外徑和高度略高于模型設(shè)定值，而直接打印樣本的尺寸略低于模型設(shè)定值（圖3n）。這可能是因?yàn)樵趹腋〗橘|(zhì)存在的情況下，細(xì)絲層間連接相對(duì)不那么緊密。

懸浮打印結(jié)構(gòu)體可以承受反復(fù)的高應(yīng)變拉伸（圖3o-p），說明其具有優(yōu)異的力學(xué)性能。進(jìn)一步，分別對(duì)鑄模和懸浮打印的實(shí)心圓柱體進(jìn)行軸向壓縮測試，獲得應(yīng)力-應(yīng)變曲線，并計(jì)算彈性模量（圖3q）。懸浮打印結(jié)構(gòu)的彈性模量約為鑄模結(jié)構(gòu)的兩倍（圖3r），表明MB生物墨水的懸浮打印可以應(yīng)用于軟組織結(jié)構(gòu)的制造。進(jìn)一步，以HepG2細(xì)胞為例測試懸浮打印工藝對(duì)細(xì)胞活性的影響。通過Live/Dead染色來評(píng)估細(xì)胞活性，并以載HepG2的純GelMA生物墨水作為對(duì)照（圖3s-t）。載細(xì)胞微凝膠在3D纖維中分布均勻，細(xì)胞活性略低于對(duì)照組的細(xì)胞活性（圖3u），可能原因包括MB生物墨水制備過程、Carbopol懸浮介質(zhì)以及打印過程中的剪切應(yīng)力；然而，懸浮打印結(jié)構(gòu)中HepG2細(xì)胞在前5天表現(xiàn)出比對(duì)照組更快的生長速度（圖3v）。

圖3 懸浮打印MB生物墨水構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)體

3.以MB墨水為懸浮介質(zhì)實(shí)現(xiàn)任意形狀血管打印
為驗(yàn)證MB生物墨水作為懸浮介質(zhì)的能力，將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)透明容器中，成功實(shí)現(xiàn)了犧牲性明膠墨水的懸浮打印（圖4a）。打印的細(xì)絲在不同的擠出速度下呈不同直徑，通過改變擠出速度，能夠控制細(xì)絲寬度為250 μm到1000 μm（圖4b-c）。MB生物墨水的流變性受溫度影響較小，但打印保真度在一定程度上仍會(huì)受到溫度變化的影響（圖4d）。為實(shí)現(xiàn)以MB生物墨水為懸浮基質(zhì)的打印，將MB生物墨水填充到特定形狀的透明模具中，設(shè)計(jì)并打印了一條仿生的分叉通道（圖4e）。打印后，進(jìn)行光交聯(lián)（圖4f-g），將溫度提高到37 ℃去除明膠，得到中空的通道。在通道中用藍(lán)色墨水灌流，證明它們的可灌注性（圖4h）。進(jìn)一步制備載HepG2的MB生物墨水作為懸浮介質(zhì)，在其中打印了可灌流通道，載HepG2的MB生物墨水的初始細(xì)胞活性為90%（圖4i）。灌流培養(yǎng)18小時(shí)后觀察，證明了通道灌流能夠顯著提高整個(gè)組織的細(xì)胞活性（圖4j）。

進(jìn)一步，使用載HUVEC的明膠墨水可以在結(jié)構(gòu)體中形成內(nèi)皮化通道，在第3天，觀察到HUVECs均勻分布在通道中（圖4k）。第7天，細(xì)胞增殖使得通道內(nèi)形成一層均勻的內(nèi)皮層（圖4l），同時(shí)遷移到周圍基質(zhì)中（圖4m）。此外，將紅色MB生物墨水在透明MB生物墨水中懸浮打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，擠出保真度良好（圖4n-o）。墨水和懸浮介質(zhì)分別使用紅色和綠色GelMA微凝膠，實(shí)現(xiàn)了打印墨水分布可視化（圖4p）。這些結(jié)果都直接表明MB生物墨水既可以作為打印墨水，也可以用作懸浮介質(zhì)。

圖4 MB生物墨水作為打印的懸浮介質(zhì)

4.SPIRIT打印工藝
如前述，BRE團(tuán)隊(duì)開發(fā)了新型逐級(jí)懸浮打�。⊿PIRIT）技術(shù)，打印過程如下：（i）一級(jí)打�。簩�MB生物墨水打印到Carbopol或明膠微顆粒懸浮介質(zhì)中，構(gòu)建復(fù)雜的外部結(jié)構(gòu)；（ii）二級(jí)打印打印：在一級(jí)打印完成后，將犧牲墨水打印到尚未交聯(lián)的一級(jí)打印結(jié)構(gòu)中，利用MB生物墨水的可逆自愈合性質(zhì)來構(gòu)建任意形狀的血管網(wǎng)絡(luò)；（iii）交聯(lián)：通過原位光交聯(lián)或溫度交聯(lián)，使打印的組織結(jié)構(gòu)固化交聯(lián)，同時(shí)保持步驟（i-ii）中打印結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)完整性；（iv）去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水：通過溫度變化或稀釋等方式去除懸浮介質(zhì)從而得到打印結(jié)構(gòu)，而犧牲墨水可以同時(shí)或單獨(dú)去除（圖5a）。與現(xiàn)有3D打印技術(shù)相比，SPIRIT技術(shù)可以構(gòu)造出具有復(fù)雜外部和內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的組織和器官。

為探究墨水濃度對(duì)打印性能的影響，分別制備了含5wt%和7.5wt% GelMA MB生物墨水，使用Carbopol懸浮介質(zhì)和紅色明膠來測試SPIRIT打印。在一級(jí)打印階段，5%和7.5 % MB生物墨水在Carbopol懸浮介質(zhì)中均順利打印成中空管狀結(jié)構(gòu)；然而在二級(jí)打印階段，針頭在7.5 % MB生物墨水中會(huì)出現(xiàn)移動(dòng)和旋轉(zhuǎn)（圖5c），而5 % MB生物墨水則不明顯（圖5d）。可能原因是7.5% MB生物墨水的剪切屈服應(yīng)變遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于懸浮介質(zhì)，而5% MB生物墨水的剪切屈服應(yīng)變則明顯低于懸浮介質(zhì)（圖5e-f）。因此，采用5 % MB生物墨水打印了含螺旋細(xì)絲的管狀結(jié)構(gòu)（圖5g-h），在去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水后，成功用藍(lán)色培養(yǎng)液進(jìn)行灌流（圖5i）。螺旋通道的尺寸接近設(shè)計(jì)值，表明SPIRIT打印具有良好的結(jié)構(gòu)保真度（圖5j）；重復(fù)試驗(yàn)中結(jié)構(gòu)尺寸都非常相似，證明了SPIRIT技術(shù)具有高度可重復(fù)性（圖5k）。

圖5 基于MB生物墨水的SPIRIT工藝研究

5.SPIRIT打印含分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu)
心臟是一個(gè)中空的腔室器官，具有非常密集的血管網(wǎng)絡(luò)，然而現(xiàn)有生物3D打印技術(shù)尚無法構(gòu)建兼具多腔室和血管網(wǎng)絡(luò)的組織結(jié)構(gòu)，因此本研究以血管化心室模型的打印來證明SPIRIT技術(shù)的打印能力。首先，創(chuàng)建了一個(gè)簡化的心室模型，設(shè)計(jì)了一個(gè)位于心室模型中間表面的分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)（圖6a-b）。在使用MB生物墨水打印心室結(jié)構(gòu)后（圖6c），繼續(xù)采用紅色明膠墨水進(jìn)行二級(jí)打印以創(chuàng)建血管網(wǎng)絡(luò)（圖6d-f）。在二級(jí)打印階段，通過控制掃描次數(shù)或在恒定掃描速度下改變擠出速度來調(diào)節(jié)每個(gè)分支的直徑，最終成功打印了具有分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu)（圖6g-h）。在去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水之后，心室內(nèi)分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)行反復(fù)的灌流（圖6i-j）。為充分測試SPIRIT的打印能力，本研究設(shè)計(jì)了一種更復(fù)雜形狀的血管網(wǎng)絡(luò)。首先在二維平面設(shè)計(jì)了一個(gè)樹枝狀血管網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步彎曲以形成類似于冠狀動(dòng)脈的血管網(wǎng)絡(luò)（圖6k）。氧傳遞的數(shù)值模擬結(jié)果顯示致密的血管網(wǎng)絡(luò)可以顯著提高心肌腔室的氧供給效率（圖6l）。利用SPIRIT工藝成功打印了一個(gè)具有變化直徑的致密血管網(wǎng)絡(luò)（圖6m-n）。對(duì)打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行微CT掃描，生成設(shè)計(jì)模型和打印結(jié)構(gòu)之間偏差的云圖（圖6o），證明SPIRIT打印具有高形狀保真度。需要注意的是，即使被打印噴嘴剪切了數(shù)百次，打印心室的幾何形狀仍然完好無損。

進(jìn)一步評(píng)估打印心室的功能，采用新生大鼠心肌細(xì)胞（NRVCs）制備了MB生物墨水，并打印簡化心室結(jié)構(gòu)（圖6p）。將打印的心室剪切成數(shù)片（圖6q），并使用共聚焦成像來獲得結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信息。Live/Dead染色表明，在體外培養(yǎng)過程中，打印的血管網(wǎng)絡(luò)極大地促進(jìn)了打印組織的活性（圖6r-s）。第10天，打印的心肌組織發(fā)生同步收縮（圖6f），免疫熒光染色證實(shí)了肌原纖維的形成和細(xì)胞的相互連接，表明打印心室的初步成熟（圖6u）。這些結(jié)果證實(shí)了SPIRIT打印心肌組織具有正常功能，顯示了SPIRIT技術(shù)在器官打印等醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的應(yīng)用前景。

圖6 SPIRIT打印含可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的腔室結(jié)構(gòu)

總結(jié)與展望
本研究開發(fā)了一種新型逐級(jí)懸浮生物3D打�。⊿PIRIT）技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)外部復(fù)雜結(jié)構(gòu)和內(nèi)部精細(xì)特征的耦合打印構(gòu)建，并首次打印了一個(gè)具有復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu)，其具有良好的灌注性和收縮性能。此外，SPIRIT技術(shù)能夠縮短打印時(shí)間，很好地兼容現(xiàn)有的懸浮介質(zhì)和犧牲墨水體系，并可拓展到其他具有剪切稀化和自愈合特性的水凝膠墨水（如超分子水凝膠），為復(fù)雜組織/器官的體外功能重建提供了新的解決方案。

參考文獻(xiàn)：Fang Yongcong, Guo Yihan, Wu Bingyan, et al. Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks. Advanced Materials, 2023, 2205082.

doi: 10.1002/adma.202205082

關(guān)于BRE團(tuán)隊(duì)：
Bioprinting and Regeneration Engineering（BRE）：清華大學(xué)生物制造中心生物打印與再生工程團(tuán)隊(duì)，聚焦生物制造、生物3D打印、再生醫(yī)學(xué)、組織工程等前沿領(lǐng)域，分享進(jìn)展，交流體會(huì)。