雙水相嵌入（生物）3D打印構建無海藻酸、獨立、可灌注的超細和超薄壁管狀結構

目前，生物工程纖維、血管在再生醫(yī)學和藥物篩選等應用中的需求越來越大，但生物工程纖維、血管移植物的真正可用性仍然非常有限。近些年，3D生物打印技術為移植和再生提供了一種潛在的纖維、血管或血管化組織結構的制備方法，盡管在3D生物打印方面相對較大尺寸的纖維、類血管的制備取得了一定的成功，但具有超細直徑纖維或具有超薄壁的類血管結構的制造仍然是一項嚴峻的挑戰(zhàn)。最近，哈佛大學Y. Shrike Zhang教授課題組對這一重要問題進行了深入系統(tǒng)的研究，提出了一種利用雙水相嵌入3D生物打印策略打印纖維或管狀結構。該策略采用高度生物可相容的生物水凝膠，利用互不相容的雙水相設計，打印過程中不再需要借助海藻酸鈉水性體系結構，不僅如此，該體系允許生物墨水在不混溶的水性支撐浴中自由構筑微纖維和管狀結構。該打印策略具有極限制造能力，可以打印直徑為3 μm的固體纖維或直徑為40 μm、壁厚低至5 μm的管狀結構。通過進一步接種內皮細胞驗證了該策略所構建微血管結構可以作為內皮細胞的有效載體，并驗證了部分功能化和血管萌芽等。該策略將作為一個平臺，可以滿足未來不同類型的潛在生物醫(yī)學和其他應用的需求，特別是與用于再生醫(yī)學和組織模型工程的超小直徑和超薄壁的管狀組織有關的應用。

圖 1. 通過雙水相嵌入（生物）打印策略，打印無海藻酸、獨立、可灌注的超細和超薄壁管狀結構打印過程示意圖。

研究者提出的雙水相水下嵌入打印策略結合了雙水相和同軸微流體生物打印技術，主要基于一種可光交聯(lián)的甲基丙烯酰化明膠（GelMA）作為水性生物墨水，以及聚氧化乙烯 （PEO）作為水性支持浴。在一定濃度下，GelMA和PEO在形成的雙水相系統(tǒng)中不相混溶，當調整兩個水相的參數(shù)時，GelMA 生物墨水可以以嵌入的方式直接擠出到PEO支持浴中，打印形成穩(wěn)定的3D圖案。生物墨水不僅限于GelMA, 還包括透明質酸等。

圖2. 優(yōu)化、調節(jié)打印參數(shù)，使打印纖維能獲得更大范圍的尺寸可調節(jié)性。

使用此生物打印策略，通過調節(jié)噴嘴直徑、墨水流量和打印噴頭移動速度等打印參數(shù)，可以制備直徑在10-700 μm之間的GelMA固體纖維（圖2 A），這表明打印GelMA纖維具有簡便性和強大的尺寸可調性。除了使用金屬針作為噴嘴外，研究者還采用了玻璃毛細管來打印超細纖維，通過毛細管打印能夠進一步優(yōu)化GelMA纖維直徑范圍，可以制備從3 μm到60 μm的纖維（圖2 B），這有利于進一步擴展組織生物制造的應用，因為通常情況下，均質水凝膠或顆粒狀水凝膠被用作水下擠出打印的支持浴時，由于機械阻力較高通常無法順利移動和打印出超細的纖維，而利用研究者提出的打印策略，玻璃毛細管可以在PEO為主體的水溶液支持浴中順利移動和打印（圖2 C-i）。此外，研究者展示了自制的、具有漸變尖端的超細玻璃毛細管也可以很容易地在PEO為主體的支持浴中從一側轉移到另一側（圖2 C-ii 上）。然而，在相同條件下，當使用凝膠支持浴時，沿毛細管路徑的大量氣泡被引入凝膠浴系統(tǒng)（圖2 C-ii下)�？偟膩碇v，雙水相嵌入打印策略克服了迄今為止水下生物打印的一個普遍挑戰(zhàn)。使用雙水相策略與機械擠壓方法相結合的另一個優(yōu)勢在于，它不僅允許重復修改打印圖案，在使用動態(tài)配置的梯度濃度溶液作為支持浴時，還可以進一步實現(xiàn)形狀可重構的四維（4D）打印。

圖3. 表面化學交聯(lián)誘導中空管狀纖維的形成。

此外，由于研究人員能夠實現(xiàn)在如上所述的PEO支持浴中直接打印GelMA纖維，他們設想通過表面交聯(lián)方法制備壁厚可調節(jié)的中空管狀纖維結構�；�于此，研究者們創(chuàng)新性的提出采用微生物谷氨酰胺轉氨酶（MTG）作為表面化學交聯(lián)劑，通過四個步驟在PEO收集浴中生成管狀結構（圖3 A）。通過控制MTG交聯(lián)時間，能夠精確地調整管狀結構的壁厚從10 μm到100 μm不等，直至形成固體水凝膠纖維（圖3 B）。

圖4. 同軸打印基于GelMA的管狀結構。

傳統(tǒng)同軸濕紡已被廣泛用于高通量制備中空管狀結構，基于此，同軸微流體生物打印方法也可以實現(xiàn)灌注管狀結構圖案的3D打印，正如研究者先前所報道的部分工作（Advanced Materials, 2018, 30, 1706913；Science Advances, 2022, 8, eabq6900）。然而，同軸擠壓策略有兩個關鍵限制。首先，它通常需要在海藻酸鈉的存在下進行，海藻酸鈉是一種可以通過二價陽離子（如Ca2+）物理交聯(lián)的生物材料，以確保擠出過程中的快速成型。因此，海藻酸鈉必須單獨或混合作為生物墨水中的一種成分。一般情況下，除非經(jīng)過化學修飾或制備后犧牲掉，否則海藻酸鈉會限制細胞生長和伸展。盡管研究者最近證明，通過將明膠復合生物墨水擠出到冰水支持浴中可以制備不包括海藻酸鈉的管狀結構（ACS Biomaterials Science & Engineering, 2019, 5, 5514），但這無法解決第二個挑戰(zhàn)。通常，同軸擠出的管狀纖維的直徑和壁厚保持在相對較大的尺寸上，所制備管狀結構的內徑無法輕易低于100 μm，壁厚最小為幾十微米。即使研究者在之前的工作中提出了收縮打印法將內徑減小到低于50 μm（Nature Communications, 2020, 11, 1267），但管壁厚度還是無法低于50 μm。毫無疑問，進一步減小管狀結構內徑和控制壁厚小于50 μm仍是一項巨大的挑戰(zhàn)。為此，研究人員通過利用所提出的雙水相嵌入同軸打印策略，證明了極大范圍地調節(jié)管狀結構直徑和壁厚的可行性。研究者使用自制的雙層同軸噴嘴，其中GelMA從殼層輸送，而PEO從芯層共同輸送到水性PEO支撐浴中，最終使用光交聯(lián)固化后形成GelMA水凝膠管狀結構（圖4 A）。進一步，可以輕易地通過改變水凝膠的流量、打印噴頭的移動速度等來調節(jié)管狀結構直徑和壁厚。研究表明，使用該同軸噴嘴可以獲得傳統(tǒng)的同軸濕法或生物打印設備中不可能實現(xiàn)的管狀結構尺寸，例如內徑最小可達37 μm、而壁厚最小可達4 μm（圖4 B-E）。此外，為了說明超薄管壁的實際應用，研究者制備了不同壁厚的管狀結構。使用自制的灌流裝置分析了攜氧紅細胞在管狀結構中氧氣的擴散情況，結果表明，具有超薄壁特征的管狀結構可以加速氧氣的擴散，這也將適用于其他生物分子。這顯示出了雙水相水下嵌入同軸打印策略比傳統(tǒng)同軸法打印的壁厚更能模擬毛細血管或小血管的物質傳輸。同時，研究者也進一步打印了由管狀纖維組成的復雜三維結構（圖4 F），這表明該打印策略能夠完成復雜的3D結構的打印，利用該方法研究人員也成功打印了血管化的腫瘤組織模型。

圖5. 同軸打印的管狀結構內的細胞行為。

研究者隨后開始評估雙水相水下嵌入打印策略的細胞相容性。研究者設計了一種微流控芯片裝置，將人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）接種到管腔內。細胞在接種后逐漸從圓形開始伸展，最后形成紡錘形（圖5 A）。培養(yǎng)7天后，細胞活力高達98%（圖5 A，圖5 B-i）。在7天的培養(yǎng)過程中，HUVECs保持了很強的代謝活性，細胞鋪展面積逐漸增加（圖5 B-ii 和 iii）。 通過肌動蛋白染色，可以觀察到培養(yǎng)第1天，細胞分布均勻，貼壁緊密，細胞生長和重組明顯，在第7天后形成覆蓋整個管腔內表面的致密單層結構（圖5 C和D）。并且，在培養(yǎng)期間，內皮細胞在管狀結構內表達出了明顯的人緊密連接蛋白1（ZO-1，圖5 E）。研究人員為了證明無海藻酸鈉引入的優(yōu)勢，利用GelMA管狀結構進行了萌芽誘導實驗，結果證明與基于藻酸鈉的管狀結構不同，只有GelMA組成的管狀結構很容易地被內皮細胞重塑、形成萌芽和多尺度血管化。這些結果表明，雙水相水下嵌入打印策略制備的工程血管具有很好的細胞相容性，有利于內皮細胞生長、伸展、功能化和多尺度血管化的實現(xiàn)。實驗過程中，研究人員分別使用人臍靜脈內皮細胞和腎臟近曲小管上皮細胞進行了驗證。

圖6. 同軸打印的管狀組織的寬尺寸可調整性。

具有大范圍可調節(jié)的工程血管是成功復制血管結構和功能以用于轉化應用的重要一步。傳統(tǒng)的同軸微流體生物打印通常不允許形成具有超細直徑或超薄壁的血管導管。研究者成功地在管狀結構（直徑從40到2000 μm，相應的壁厚從5到500 μm）的內腔表面接種了內皮細胞（圖6），初步證明雙水相水下嵌入（生物）打印策略具有靈活性，可以實現(xiàn)制備大范圍、可調節(jié)的類血管結構。該打印策略打印的管狀組織尺寸接近或完全覆蓋人體血管尺寸，為滿足不同類型應用的需求提供了可能性，特別是對于具有非常小直徑和壁厚的血管尺寸的應用。

以上相關成果以 “Liquid-Embedded (Bio)printing of Alginate-Free, Standalone, Ultra-Fine, and Ultra-Thin-Walled Cannular Structures” 為題發(fā)表在《PNAS》上。文章通訊作者為Y. Shrike Zhang教授。文章第一作者為唐國勝（Guosheng Tang）教授，哈佛大學聯(lián)培博士、博士后。論文共同第一作者為哈佛醫(yī)學院Dr. Zeyu Luo、Dr. Liming Lian，其它作者還包括哈佛醫(yī)學院Dr. Jie Guo、Dr. Sushila Maharjan、Carlos Ezio Garciamendez-Mijares、Prof. Mian Wang、Prof. Wanlu Li、Zhenrui Zhang、Dr. Di Wang、Prof. Maobin Xie、Prof. Hossein Ravanbakhsh、Dr. Cuiping Zhou、Dr. Xiao Kuang 和廣州醫(yī)科大學Dr. Yingying Hou、Prof. Xiyong Yu等。

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https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2206762120