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2022-12-21 16:19 上傳
組織樣式與許多生物過程相關(guān),包括細胞數(shù)量,大小,形狀和位置的改變,上述過程也可能導(dǎo)致組織對稱性破壞,產(chǎn)生屈曲,折疊,撕裂,出芽或分支等現(xiàn)象。在分子水平上,組織的行為受內(nèi)在基因表達和各種物理化學(xué)因素的調(diào)控。雖然化學(xué)物質(zhì)梯度在發(fā)育生物學(xué)中起到關(guān)鍵作用,但是三維(3D)細胞外間質(zhì)(ECM)中的力學(xué)刺激在調(diào)節(jié)組織和形態(tài)發(fā)生方面也同樣起到關(guān)鍵作用。盡管已有大量研究探索剛度對組織結(jié)構(gòu)中的影響,然而基質(zhì)的粘彈性在組織發(fā)生中的作用尚不明確。事實上,ECM的隨時間改變的粘彈性特征越來越被認為是形態(tài)發(fā)生中的重要參與者,且基質(zhì)粘彈性已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)單細胞行為,但是它是如何調(diào)節(jié)群體細胞行為還不清楚。研究人員假設(shè)了組織結(jié)構(gòu)將受到基質(zhì)的粘彈性特性的影響,設(shè)置了彈性固體到粘性液體等不同粘彈性組別,應(yīng)力松弛時間范圍從1秒到幾百秒不等。實驗結(jié)果明確證明了粘彈性基質(zhì)/生物墨水在常用的體外發(fā)育和病理模型(乳腺癌生長和腸類器官發(fā)育)中可調(diào)節(jié)組織結(jié)構(gòu),同時證明了應(yīng)力松弛可以影響組織生長動力學(xué)和手指樣的不對稱結(jié)構(gòu)形成,是形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生的基本過程。 基質(zhì)材料/生物墨水的配置文章首先研究了粘彈性生物墨水對 MCF10A 非惡性乳腺上皮細胞團簇組織生長的影響,MCF10A 乳腺上皮細胞以被廣泛用于研究乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生。選擇由天然多糖海藻酸鹽形成的水凝膠作為生物墨水,因為哺乳動物細胞不表達降解該聚合物的酶,從而消除與基質(zhì)降解有關(guān)的影響。這些凝膠的相對粘彈性可以獨立于剛度,孔徑和粘附配體地改變。改變方法是通過改變海藻酸鹽的分子量和鈣交聯(lián)劑的濃度來實現(xiàn)粘彈性變化,以創(chuàng)建固定彈性模量(G ′≈5,000 Pa)的生物墨水,但是不同組別應(yīng)力松弛時間在30s到350s變化,具體為彈性體應(yīng)力松弛時間更長粘彈性體改時間更短。由于海藻酸鹽不存在整聯(lián)蛋白粘附配體,所以將含有 Arg-Gly-Asp (RGD)的肽綴合到聚合物骨架上以在所有凝膠中提供恒定水平的細胞結(jié)合位點。
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2022-12-21 16:20 上傳
圖1. A,示意圖說明如何同時改變聚合物的分子量和交聯(lián)程度允許在恒定的凝膠剛度下改變粘彈性能。B,所得海藻酸鹽水凝膠的儲存模量 (每個條件 n = 5,9個凝膠)。C,在一定應(yīng)變下,最初施加的應(yīng)力放松到原始值的一半的時間尺度的量化。D,MCF10A 細胞團簇在彈性和粘彈性水凝膠中生長超過5天的實例。青色,鬼筆環(huán)肽; 洋紅色,Hoechst。面積(e)和圓度(f)的量化。G,在彈性和粘彈性凝膠中生長的 MCF10A 細胞球體中磷酸化 FAK 人黏著斑激酶。灰色,pFAK; 洋紅色,Hoechst (每個條件 n = 3,4個圖像)。H,彈性和粘彈性凝膠(球體核心細胞和分支細胞)中球體的鬼筆環(huán)肽(青色) ,Hoechst (洋紅色)(上排)和 YAP (下排)染色的代表性例子。I,每個圖像具有核 YAP 的細胞百分比的染色進行定量。 粘彈性生物墨水對乳腺癌團簇生長的影響隨著時間的推移,彈性基質(zhì)中的組織生長緩慢,形態(tài)穩(wěn)定; 它們在保持球形對稱性的同時體積增大。然而,粘彈性基質(zhì)中的組織生長得更快。隨著尺寸的增加,它們表現(xiàn)出形態(tài)不穩(wěn)定性,球形對稱性被破壞,形成手指突出并侵入基質(zhì)材料,導(dǎo)致表面積顯著增加和圓度降低。這些差異是由生物墨水力學(xué)特性的變化引起的,研究接下來集中在細胞中的兩個力學(xué)敏感通路,粘著斑激酶(FAK)和機力學(xué)敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 YAP。粘彈性生物墨水促進磷酸化的 pFAK 粘附的表達和形成,但彈性生物墨水中沒有類似現(xiàn)象,而 YAP 保留在彈性生物墨水細胞的細胞質(zhì)中,但在粘彈性生物墨水中移位到指狀突出細胞的細胞核中。
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2022-12-21 16:30 上傳
A, 在粘彈性凝膠中生長的細胞團簇中波形蛋白(青色) ,鬼筆環(huán)肽(洋紅色)染色。B,彈性水凝膠中球體外環(huán)和粘彈性水凝膠中指狀突出中波形蛋白平均強度的定量。C, 鬼筆環(huán)肽和 Hoechst (左)和細胞角蛋白14(右)在粘彈性和彈性水凝膠球體染色的例子。青色,鬼筆環(huán)肽; 洋紅色,霍克斯特; 黃色,細胞角蛋白14。D,球體外環(huán)平均細胞角蛋白14強度的定量。E-g,彈性和粘彈性基質(zhì)中球體中 Snail (e) ,Slug (f)或 Zeb1(g)陽性細胞百分比的定量。H,第0天用含有 MDA-MB-231乳腺上皮細胞的粘彈性和彈性水凝膠注射的小鼠中腫瘤體積的定量。I,在彈性和粘彈性水凝膠中 MDA-MB-231的鬼筆環(huán)肽和 Hoechst 染色。青色,鬼筆環(huán)肽; 洋紅色,Hoechst。J,植入裸鼠體內(nèi)的粘彈性和彈性水凝膠中 MCF10A 球體的鬼筆環(huán)肽和 Hoechst (左) ,線粒體(中)和波形蛋白(右)染色。K,植入小鼠體內(nèi)7天的彈性和粘彈性基質(zhì)中球體中的slug陽性細胞百分比的定量。 粘彈性生物墨水中觀察到的行為更符合真實細胞行為,包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMTs)。波形蛋白在指狀突出中表達更高,細胞角蛋白在粘彈性基質(zhì)中的細胞團簇中表達低,EMT 轉(zhuǎn)錄因子 Snail,Slug 和 Zeb1在粘彈性基質(zhì)中的細胞中表達更高。此外,許多癌癥相關(guān)通路在彈性基質(zhì)內(nèi)的細胞中沒有改變,但在粘彈性剛性水凝膠中上調(diào)。為了確定粘彈性是否可以增強細胞團簇在體內(nèi)的生長,我們采用了兩種方法。首先,在 NOD-SCID 小鼠體內(nèi)注射包裹在粘彈性或彈性生物墨水中的MDA-MB-231惡性乳腺上皮細胞,腫瘤在粘彈性基質(zhì)中的生長速度明顯快于彈性基質(zhì)。MDA-MB-231細胞在體外也生長得更快。其次,將包裹在粘彈性或彈性基質(zhì)中的MCF10A 細胞團簇注射到 NU/J 小鼠體內(nèi)。1周后,研究觀察到粘彈性基質(zhì)中細胞的顯著生長和指狀突出形成,而彈性基質(zhì)中的細胞僅顯示有限的生長。此外,體內(nèi)的細胞在粘彈性生物墨水中表達更多的波形蛋白和 Slug。研究結(jié)果表明,基質(zhì)粘彈性可以促進 EMT 和腫瘤生長。 粘彈性生物墨水對群體細胞行為的影響作用模型為了理解組織形態(tài)對稱性破壞的量化條件,研究引入最小系統(tǒng)理論模型,從限制在粘彈性生物墨水內(nèi)生長的活性增殖細胞的兩相系統(tǒng)開始。將組織中的單個細胞模擬為在粘性液體中大小一定的過阻尼軟彈性球體,其在三種力的影響下移動: (1)細胞之間的相互作用,包括(a)短程排斥以防止重疊和(b)中間范圍(兩個細胞長度)的吸引力,兩者一起產(chǎn)生由細胞分裂增殖驅(qū)動的壓力;(2)細胞與周圍粘彈性生物墨水之間的作用力包括(a)相互作用的吸引勢,該值與儲存模量 G ′相關(guān)和(b)防止重疊的短程斥力;以及(3)相對于彼此在生物墨水內(nèi)隨機移動的活細胞,擁有屬性為運動能力M。此外,在該模型中,假定界面處的細胞具有對周圍基質(zhì)材料施加力的能力。整個系統(tǒng)隨著細胞的增殖和/或遷移而變化,基質(zhì)材料對伴隨細胞施加的壓力做出被動的反應(yīng)。當(dāng)應(yīng)力超過規(guī)定的閾值時,基質(zhì)材料中細胞與基質(zhì)之間的結(jié)合位點可能斷裂,從而形成新的結(jié)合位點; 這最有可能發(fā)生在組織與基質(zhì)材料的界面處,從而導(dǎo)致了邊界的動態(tài)演變。其次,潛在的機制驅(qū)動組織運動和增殖的細胞規(guī)模進行了探討。之前的研究認為,單個細胞對三維和二維粘彈性的反應(yīng)是由肌動球蛋白收縮力或拉伸離子通道調(diào)節(jié)而導(dǎo)致。而該模型顯示,細胞通過推動基質(zhì)產(chǎn)生分裂和遷移的空間。與此相一致的是,當(dāng)模型中的細胞增殖速率受到抑制時,預(yù)測組織生長和不穩(wěn)定性將大大減少。對于彈性生物墨水中的細胞,細胞分裂將在空間上局限于生長組織和基質(zhì)材料之間的邊界,但是對于粘彈性基質(zhì)中的細胞,細胞分裂將更廣泛地分布在整個生長組織。另外基于上述假設(shè)的模擬預(yù)測隨著基質(zhì)材料模量的增加,組織形態(tài)不穩(wěn)定性將增強。
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2022-12-21 16:30 上傳
A,組織的主動運動是基質(zhì)剛度的正相關(guān)函數(shù),B-D,最終時間點模擬圖像,投影面積和圓度。通過進一步改變彈性和粘彈性凝膠中的交聯(lián)程度,改變了實驗生物墨水的剛度。F,實驗樣品在彈性和粘彈性的不同剛度基質(zhì)材料培養(yǎng)5天的面積和G圓度。H,在細胞運動能力歸零后的模型模擬結(jié)果。I,具有 Rac1(NSC23766)和 Arp2/3(CK666)抑制劑的軟和硬粘彈性基質(zhì)中培養(yǎng)5天后的樣品。J,模型預(yù)測的彈性/粘彈性材料中不同剛度下的細胞增殖。K,不同培養(yǎng)條件下EdU 陽性細胞百分比。 粘彈性生物墨水對類器官生長的影響研究也進行了粘彈性生物墨水對自組織腸類器官生長的影響評估。粘彈性生物墨水同樣促進了腸類器官生長,對稱性破壞和隱窩形成,但類器官在彈性生物墨水中生長更緩慢,并保持其球形對稱?偟膩碚f,這些結(jié)果驗證了生物墨水粘彈性對組織生長影響模型的普適性。
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2022-12-21 16:31 上傳
A,用于類器官研究的海藻酸鹽和基質(zhì)膠共混生物墨水示意圖。粘彈性受聚合物分子量和交聯(lián)劑濃度控制,而 Matrigel 的濃度保持不變。B,彈性和粘彈性海藻酸鈉-基質(zhì)膠互穿網(wǎng)絡(luò)的儲存模量。C,培養(yǎng)7天的彈性和粘彈性水凝膠中的腸類器官鬼筆環(huán)肽和 Hoechst 染色。青色,鬼筆環(huán)肽; 洋紅色,Hoechst。D,E,在彈性和粘彈性基質(zhì)中7天內(nèi)的類器官面積和圓度變化。F,在較硬的粘彈性凝膠中培養(yǎng)7天后Lgr5 + ,鬼筆環(huán)肽和 Hoechst腸類器官染色。左: Lgr5 + (洋紅色)和 Hoechst (青色) ; 右: 鬼筆環(huán)肽。G,在較硬的粘彈性凝膠中培養(yǎng)7天后溶菌酶,鬼筆環(huán)肽和 Hoechst 染色。每個條件 n = 9個圖像。左: 溶菌酶(洋紅色)和 Hoechst (青色) ; 右: 鬼筆環(huán)肽。H,不同生物墨水中GFP+和聚落形成對比。 結(jié)論 該研究證明了粘彈性生物墨水如何調(diào)節(jié)群體細胞行為,暗示對稱性的破壞與許多生理過程相關(guān),包括胚胎發(fā)生,癌發(fā)生,分支形態(tài)發(fā)生和血管生成。同時提供一個思路來了解組織在正常和病理狀態(tài)的形態(tài),并用相圖策略來指導(dǎo)組織形態(tài)調(diào)控和再生醫(yī)學(xué)。 參考文獻
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