CJPRS|首都醫(yī)科大學附屬北京積水潭醫(yī)院矯形骨科陳明學醫(yī)生基于低溫沉積 3D 打印技...

半月板復雜結構和功能以及有限血供使其再生修復依然充滿挑戰(zhàn)。近日，首都醫(yī)科大學附屬北京積水潭醫(yī)院矯形骨科陳明學醫(yī)生基于低溫沉積3D打印技術構建新型組織工程半月板支架，評價該支架理化性質及生物相容性。該文章名為“Construction of a novel tissue engineered meniscus scaffold based on low temperature deposition three-dimenisonal printing technology”，發(fā)表在Chinese Journal of Reconstructive and Reconstructive Surgery上。本研究基于低溫沉積3D打印技術構建新型組織工程半月板支架，評價該支架理化性質及生物相容性。結果表明，脫細胞處理后半月板基質勻漿呈透明凝膠狀，DAPI和組織學染色示免疫原性的核酸去除，同時黏多糖及膠原成分保留。采用低溫沉積3D打印技術成功構建新型組織工程半月板支架，掃描電鏡示支架呈分級大孔-微孔的微觀結構；CCK-8檢測示支架具有良好細胞相容性；死/活細胞染色示支架可有效維持細胞活性(>90%)；細胞骨架染色示支架有利于細胞黏附和鋪展；支架植入大鼠皮下1周后有輕度炎癥反應，3周后未見明顯炎癥反應，并可見支架逐步降解�；�于低溫沉積3D打印技術構建的新型組織工程半月板支架具有分級大孔-微孔的微觀結構和良好細胞相容性，有利于細胞黏附和生長，為下一步體內(nèi)研究奠定基礎。

背景介紹

半月板損傷的再生修復目前依然充滿挑戰(zhàn)。近年來，隨著再生醫(yī)學和組織工程技術的發(fā)展，構建組織工程半月板支架實現(xiàn)半月板損傷的再生修復逐漸得到認可。理想的半月板組織工程支架應模擬天然半月板空間結構和微環(huán)境，有良好細胞相容性，有利于細胞生長和分化，促進損傷半月板的再生和修復。脫細胞基質由于具有仿生成分和天然微結構，在組織工程和再生醫(yī)學中得到了廣泛應用。其最大優(yōu)點在于良好生物相容性，可很好地模擬細胞生長微環(huán)境，有效促進細胞生長和分化。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)脫細胞半月板基質可有效促進細胞黏附、增殖和分化，進而促進損傷半月板再生修復，可以作為理想的生物材料。

3D打印技術可以實現(xiàn)高度個性化制造，準確制造出具備復雜結構的支架。然而，傳統(tǒng)熔融沉積3D打印技術因打印過程中需要加熱融化材料，故無法用于脫細胞半月板基質打印。 近年，低溫沉積3D打印技術的出現(xiàn)為打印該材料提供了可能。該打印技術是在超低溫(−30~ −20℃)平臺上逐層搭建支架，經(jīng)冷凍干燥和相分離技術實現(xiàn)支架高度連通的大孔-微孔結構。相對于傳統(tǒng)熔融沉積3D打印技術，其具有以下優(yōu)勢：(1)超低溫下完成打印，可以有效保護材料生物活性;(2)能構建具有高度連通的大孔-微孔結構，提高了支架孔隙率，這種分級多孔結構為細胞營養(yǎng)物質交換和擴散提供了通道。

本研究以脫細胞半月板基質為原料，[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]通過低溫沉積3D打印技術(SUNP BIOMAKER 生物打印機【上普博源（北京）生物科技有限公司】)構建新型組織工程半月板支架，評價該支架理化特性和生物相容性，為其用于體內(nèi)修復損傷半月板組織奠定基礎。

實驗方法

取新鮮豬膝關節(jié)半月板，采用改良物理化學聯(lián)合方法脫細胞處理，獲得脫細胞半月板基質勻漿；經(jīng)大體觀察、HE及DAPI染色觀察脫細胞效果，甲苯胺藍、番紅O及天狼猩紅染色評估黏多糖和膠原保留情況。然后制備脫細胞半月板基質生物墨水，通過低溫沉積3D打印技術制備新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察微觀結構；與脂肪來源干細胞共培養(yǎng)后，采用細胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）檢測支架細胞相容性，死/活細胞染色和細胞骨架染色觀察細胞活性和形態(tài)；植入大鼠皮下后組織學染色評估支架炎癥細胞浸潤與降解情況。

實驗結果

大體觀察半月板組織呈半月形或C形，脫細胞前呈乳白色纖維軟骨樣組織，質地柔軟、有彈性；脫細胞半月板基質呈透明凝膠狀。DAPI及HE染色示，脫細胞前半月板有大量細胞核結構，脫細胞處理后半月板基質未見細胞核結構，表明具有免疫原性的核酸組織徹底去除。番紅O、甲苯胺藍及天狼猩紅染色示，脫細胞前后均呈陽性，提示脫細胞過程中黏多糖和膠原成分保留。

圖1.半月板觀察   左側示脫細胞前，右側示脫細胞后

a.大體觀察；b. DAPI染色熒光顯微鏡觀察；c. HE染色；d.番紅O染色；e.甲苯胺藍染色；f.天狼猩紅染色

大體觀察見新型組織工程半月板支架呈交叉網(wǎng)格狀結構，纖維排列整齊。掃描電鏡下可見支架具有明顯縱橫交錯結構，大孔徑(直徑200~300 μm)分布較均勻，纖維徑上微孔相互連接，微孔直徑10~30 μm。(圖2a,b)

圖2. 新型組織工程半月板支架觀察

a.大體觀察；b.掃描電鏡觀察；c. CCK-8檢測細胞增殖；

d.激光共聚焦顯微鏡下培養(yǎng)1天(上)及7天(下)死/活細胞染色觀察 從左至右分別為活細胞染色、死細胞染色及兩者重疊；

e.激光共聚焦顯微鏡觀察培養(yǎng) 7天鬼筆環(huán)肽染色觀察；f、g.大鼠皮下植入后1、3周HE染色觀察。

CCK-8檢測示兩組A值均隨時間延長而增加，其中培養(yǎng)3、5天時實驗組A值大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2c)。死/活細胞染色示，支架上細胞以活細胞為主，細胞活性達90 %以上(其中1天94 %、7天95 %)(圖2d)。鬼筆環(huán)肽染色示培養(yǎng)7天后支架上細胞呈梭形、分布均勻(圖2e)。支架埋植于大鼠背部皮下HE染色示，1周時支架內(nèi)部和支架與組織交界處炎癥細胞浸潤，支架無明顯降解；3周時未見明顯炎癥細胞浸潤，支架有部分降解，支架體積和纖維直徑較植入前減小。

實驗討論

近年來，隨著半月板組織工程技術的不斷發(fā)展，體外、內(nèi)半月板替代物研發(fā)取得了許多進展。然而，半月板復雜結構和功能以及有限血供使其再生修復依然充滿挑戰(zhàn)。半月板再生過程中，支架應具有合適理化特性的結構框架，以幫助宿主細胞黏附和遷移，同時良好的仿生結構可以提供一個良好再生微環(huán)境。3D打印技術為構建復雜結構和異質性半月板提供了技術支撐。本研究采用的低溫沉積3D打印技術是近年發(fā)展起來的快速成型技術之一，它不僅基于快速沉積制造工藝，而且結合了相分離工藝。采用該技術構建的組織工程支架除了具有可控的大孔徑外，在纖維徑上還具有相互連接的微孔，這些微孔有利于細胞旁分泌，增強細胞生物學功能，在組織工程支架制備和復雜器官設計方面具有廣闊應用前景。

目前，應用于3D生物打印的生物墨水主要分為人工合成材料和天然生物材料。人工合成材料主要有聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乳酸復合物、聚乳酸等。它們雖然具有物理機械性能良好、可控性強、微結構可調節(jié)等優(yōu)點，但親水性差、對細胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料包括海藻酸鈉、明膠、膠原蛋白、殼聚糖、纖維蛋白、透明質酸和脫細胞外基質。其中脫細胞外基質保留了大部分天然成分，無免疫原性，是促進細胞增殖和分化的理想生物材料。既往文獻及本團隊研究顯示脫細胞半月板基質的多孔結構和各種功能分子能決定干細胞分化方向，可能進一步促進半月板再生。因此，本研究中我們選擇開發(fā)具有可打印性和滿足細胞相容性的脫細胞半月板基質生物墨水，并基于低溫沉積3D打印技術構建結構和成分雙仿生的新型組織工程半月板支架。

研究結果顯示，脫細胞技術成功去除半月板組織中具有免疫原性的核酸組織，并很好地保留了基質生物活性成分，包括黏多糖和多種膠原蛋白；制備的脫細胞半月板基質具有可打印性，利用低溫沉積3D打印技術成功構建新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察示這種新型支架不僅具有縱橫交錯的纖維，類似天然半月板膠原排列，更重要的是纖維徑上形成了直徑10～30 μm的微孔，為細胞生長提供了黏附位點，也為細胞物質交換、廢物排出提供了通道。既往研究也表明支架多孔結構有助于細胞增殖、分化。本研究CCK-8檢測示隨著時間推移，支架上細胞增殖明顯更快、更多，死/活細胞染色示支架上細胞活性良好，只見少量死細胞，提示構建的支架具有良好細胞相容性。同時，細胞骨架染色示MSCs能很好地在支架上黏附和伸展，并保持干細胞形態(tài)。進一步將支架植入大鼠皮下觀察，植入1周有輕度炎癥反應，3周炎癥反應逐漸減輕，并出現(xiàn)支架部分降解。這種早期炎癥反應會募集巨噬細胞，通過調節(jié)巨噬細胞極化，促進組織再生修復。

實驗結論

理想的半月板組織工程支架應模擬天然半月板空間結構和微環(huán)境，有良好細胞相容性，有利于細胞生長和分化，促進損傷半月板的再生和修復。因此，本研究成功制備脫細胞半月板基質生物墨水，并利用低溫沉積3D打印技術構建一種具有大孔-微孔分級微觀結構的新型組織工程半月板支架，其能為細胞生長、黏附和增殖提供良好微環(huán)境。未來需進一步探討該支架在體外成軟骨分化作用及體內(nèi)修復損傷半月板組織的效果，為其用于半月板再生修復提供更多數(shù)據(jù)支持。

參考文獻

Chen Mingxue, Wu Jiang, Yin Han, Wei Xiang, Liu Shuyun, Guo Quanyi.Construction of a novel tissue engineered meniscus scaffold based on low temperature deposition three-dimenisonal printing technology.

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 2024, 38(6): 748-754. doi: 10.7507/1002-1892.202402063