3D打印具有生物催化功能的活體材料

來源：智能材料與再生醫(yī)學實驗室

生命的組成部分主要來源于能夠形成或組裝具有高級結構和復雜特征的生命系統(tǒng)的生物體。作為這類生物體的一個組成部分，細胞可以被招募來構建用于能量收集、傳感、修復和驅動的合成生物材料或結構。在這方面，細胞要么構建材料本身，要么以特定方式調節(jié)材料的功能性能。例如，轉基因微生物已被用于產生細胞外基質材料；這些材料已被用于多種應用，如生成自組裝層次結構、發(fā)現(xiàn)新型功能聚合物以及維持此類結構以響應環(huán)境刺激。此外，微生物可以在生物混雜材料工程中與脫細胞成分協(xié)同工作，從而產生從生物制造和生物修復到生物醫(yī)學工程的潛在應用。尤其是生物催化活性材料，由于其在廣泛領域的適用性，最近引起了科學家們越來越多的興趣。作為生物催化劑的微生物可以通過自然或精心設計的細胞內化學級聯(lián)反應將底物轉化為有價值的化學品，因此它們經常用于發(fā)酵和污染物去除等領域。盡管前景看好，但將功能微生物與生物加工相結合的想法尚未得到充分探索。一個挑戰(zhàn)是，整個過程需要在材料可制造性與細胞活力和功能性之間取得平衡。此外，由于生物加工過程的動態(tài)控制仍然是該領域最大的挑戰(zhàn)之一，因此迫切需要能夠創(chuàng)建具有明確3D形狀的定制活體材料的策略，特別是在以空間方式進行分布的同時改變其組成和功能特性。

有鑒于此，南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室的余子夷、陳蘇教授團隊開發(fā)了一種具有生物催化功能的活體材料，其由雙網(wǎng)絡高分子和微生物細胞共同構成，并且其可用作生物墨水，通過生物3D打印設備進行精準制造。

相關研究工作以 “3D Printed Biocatalytic Living Materials with Dual-Network Reinforced Bioinks” 為題發(fā)表在《SMALL》期刊上，該研究得到了國家重點研發(fā)計劃 “合成生物學”重點專項、國家自然科學基金、江蘇省自然科學基金等項目的資助。

NO.1

為了生成可印刷油墨，首先，在室溫下，在 PBS 緩沖鹽水中，將全功能化的 HA 聚合物與 CB[8] 預復合。HA 中帶 N 端電荷的苯丙氨酸能夠與 CB[8] 以 2:1 的比例形成同質復合物，從而產生具有物理交聯(lián) 3D 網(wǎng)絡和宏觀可逆觸變性的超分子凝膠（圖 1a）。然后通過將超分子凝膠與微生物混合來獲得生物墨水。

其次，使用載有微生物的 CB超分子水凝膠來數(shù)字打印有利于長期細胞功能的活體 3D 支架。Bioinks 被加載到配備三軸機械機械臂的壓力控制分散盒中（圖 1b）。為了確定打印分辨率，作者分別打印了具有 1500、840、580、410 和 250 μm 不同噴嘴直徑的 2D 蛇形圖案（圖S6，支持信息）。打印的細絲在整個圖案上具有均勻的厚度，在 250 μm 處顯示出良好的打印分辨率。CB[8] 介導的超分子水凝膠適用于 3D 打印，因為它在通過打印針擠出時具有剪切稀化行為（圖 1c））。打印完成后，在紫外線輻射下啟動二次共價交聯(lián)，以提高結構的機械性能，這有利于水凝膠的進一步處理和長期細胞培養(yǎng)（圖 1d）。

圖1 基于功能化的透明質酸的雙交聯(lián)載體的設計

圖S6  噴嘴直徑分別為250微米、410微米、580微米、840微米和1500微米的二維蛇形圖案（從左到右）比例尺為3毫米

NO.2

圖 2c表明 CB-HA 和 CB-HA-細胞的臨界應變約為 200%，而 HA-細胞的損耗模量幾乎等于其儲能模量，進一步表明添加 CB 交聯(lián)劑后機械性能的提高。紫外線照射后，材料的儲能模量增加了10倍，在8000Pa左右。值得注意的是，材料中酵母細胞的存在并未顯著改變其流變行為，因為線性粘彈性區(qū)域中含有細胞的樣品的動態(tài)模量與不含細胞的樣品的動態(tài)模量接近。此外，應變恢復是基于軟物質的 3D 打印應用的關鍵特征，因為它可以快速恢復機械性能，從而確保打印后的結構保真度。 圖2d表示了水凝膠的循環(huán)流變測試。在較低的應變下，水凝膠儲能模量超過損耗模量，并在應變急劇變化后立即以相反的方式表現(xiàn)。剪切稀化是設計 3D 可打印墨水的另一個不可或缺的因素，因為它允許通過打印針輕松擠出，其中由于收縮而顯著增加了剪切應力。所有三個樣品在更高的剪切速率下都顯示出剪切稀化行為（圖 2e），顯示出它們在基于擠出的 3D 打印應用中的應用前景。除了流變學特征外，細絲塌陷（圖S7a，支持信息）和細絲融合（圖S7b），支持信息）進行了測試以表征生物墨水的機械性能。作者還通過掃描電子顯微鏡 (SEM) 檢查了生物墨水的表面形態(tài)。然后，作者探索了 CB生物墨水對基于擠出的 3D 打印平臺的適用性。生物墨水由氣泵擠出和控制，并使用機械臂來操縱噴嘴的運動以確保墨水的準確沉積（圖 2f）作為演示，制造了具有高結構的3D晶格立方體保真度。打印后，將 3D 結構在 Irgacure 2959 存在的情況下暴露于紫外線下 3 分鐘，以增強其機械剛度。為了證明 bioinks 的生物相容性，嵌入的酵母細胞用活/死熒光染料染色。如圖 2h和圖S9所示, 支持信息，在紫外線照射后，大多數(shù)酵母細胞存活，細胞活力高達 85%，這表明材料和交聯(lián)程序沒有顯著影響細胞活力。SEM 圖像顯示 3D 晶格具有亞毫米孔（圖 2i-k），具有逐層堆疊結構（圖 2j）。此外，載有細胞的 3D 晶格的 SEM 圖像顯示酵母細胞（通過成像處理呈黃色）位于 HA 基質上（圖 2k）。

圖2 活體材料的3D打印

圖S7（a） 水凝膠絲斷裂試驗的示意圖

圖S9 懸浮酵母細胞的熒光顯微圖像。比例尺代表50μm

NO.3

利用酵母對葡萄糖的厭氧發(fā)酵來證明該平臺的適用性。作者設計了一種酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 培養(yǎng)基回收裝置（圖 3a），旨在最大限度地提高發(fā)酵過程中的生產力。載有細胞的 3D 晶格與與對照組相同成分的大塊水凝膠一起制造（圖 3b）。作者首先測試了材料的細胞相容性，其中酵母細胞被嵌入大塊雙交聯(lián)水凝膠中并孵育 16 小時。結果如圖S11, 支持信息，可以注意到細胞增殖，因為孵育 16 小時后細胞密度增加。為了測量這兩個生物反應器的代謝活性，作者評估了它們在 15 小時內的整體乙醇產量，這表明 3D 晶格產生的乙醇明顯高于其本體對應物。作者進一步評估了乙醇生產力的進展和發(fā)酵過程中這兩種結構的產量。圖 3c,d總結了 3D 晶格和塊狀水凝膠的乙醇生產率和產量，按各自的權重歸一化。兩種結構都能夠從一開始就產生乙醇，而在整個發(fā)酵過程中，晶格的乙醇產率高于散裝水凝膠。作者將這種差異歸因于晶格的比表面積增加，這促進了反應物和產物與環(huán)境的交換。整體發(fā)酵動力學顯示出一條 S 形曲線，晶格和散裝水凝膠的乙醇生產率在大約 3 小時達到峰值，然后緩慢下降，直到此后達到平臺期。發(fā)酵15 小時，充滿細胞的晶格內產生了 17.9 g·L-1 的乙醇，大約是其塊狀對應物的兩倍。

圖3 生物催化活體材料的發(fā)酵性能

圖S11  在發(fā)酵和冷凍干燥一個月后，活酵母細胞在不同深度嵌入3D支架中的共焦顯微圖像。比例尺代表50μm

NO.4

為了進一步證明作者方法的多功能性，作者創(chuàng)建了一個用于生物修復的細菌-微藻共培養(yǎng)生物材料系統(tǒng)。生物修復已成為比傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢的替代方法，例如物化吸附、化學氧化等昂貴且容易造成二次污染的方法。相比之下，生物解毒更環(huán)保，因為它通過生物轉化將有害的有機化學物質代謝成無害的 CO2。在此，作者研究了用于去除丙烯酰胺和甲基橙的芽孢桿菌-小球藻共培養(yǎng)系統(tǒng)�？莶菅挎邨U菌能夠利用有機化學品作為碳源并將其轉化為 CO2，CO2依次被普通小球藻捕獲并通過光合作用轉化為氧氣（圖 4a）。反之，小球藻產生的氧氣被枯草芽孢桿菌捕獲進行有氧呼吸，形成良性生態(tài)循環(huán)。然后作者將該共培養(yǎng)系統(tǒng)固定到 CB[8] 介導的雙網(wǎng)絡水凝膠中，并通過增材制造構建 3D 晶格。細菌-微藻共培養(yǎng)系統(tǒng)的3D模型如圖4b所示 . 在共聚焦顯微鏡下，在發(fā)出強烈紅色熒光的葉綠素（圖4c）的存在下，印刷的晶格看起來是綠色的 ，這表明存在大量活的小球藻細胞。載有細胞的晶格的 SEM 圖像顯示出與含有酵母細胞的晶格相似的表面形態(tài)（圖 4d），這表明加載兩種類型的微生物不會破壞晶格的多孔結構。打印和固化后，將裝有細菌和藻類的格子支架置于合成介質中。如圖4e所示 ，支架膨脹了大約 1.5 倍的重量（圖S12，支持信息）。嵌入式共培養(yǎng)系統(tǒng)經過 12 小時光照和 12 小時黑暗循環(huán)以實現(xiàn)高性能。檢查了細菌-微藻系統(tǒng)降解有機物質的能力（圖 4f）。降解動力學表明，在前 12 小時內，大約 70% 的甲基橙被去除，而芳酰胺則被去除了 40%。48小時后，90%以上的有機物被降解。

圖4 多細胞生物活體材料用于二氧化碳固定和生物修復

圖S12  負載微生物的3D結構的溶脹率（a）負載酵母細胞，（b）負載細菌微藻

綜上，該工作利用動態(tài)化學以及雙交聯(lián)網(wǎng)絡的方法，成功開發(fā)了一種新的可打印的生物墨水，制造了在微尺度空間固定微生物和構建多細胞共生的生物活體材料，實現(xiàn)了生物催化的強化。利用3D打印技術，提高了整個材料的傳質效果，和傳統(tǒng)的大塊材料相比，顯著提高了材料的生物催化效果。同時，該材料還具有可循環(huán)性，并且在低溫或者凍干的保存條件下依然保持了良好的催化活性。這項工作為探索新的生物相容性良好的可打印生物墨水提供了一個新的突破。

文章鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.202104820