AFM綜述 | 骨組織工程中支架制造技術及其結構/功能特性

摘要：骨組織工程學（BTE）是一個快速發(fā)展的領域，旨在創(chuàng)建可以在體內(nèi)整合和降解以治療患病或受損組織的生物功能組織。支架制造技術在決定植入的生物材料的最終結構，機械性能和生物學響應方面非常重要。本文提供了有關支架制造技術，BTE的結構和功能特性的最新成就的全面綜述。提出了從無機生物材料到天然和合成聚合物以及用于支架加工的相關復合材料的不同類型的生物材料。還討論了新興的支架技術，例如靜電紡絲，冷凍干燥，生物打印和脫細胞。

引言
組織工程旨在開發(fā)新的生物功能組織，以再生和修復受損或患病的組織。2017年，全球骨科手術總數(shù)約為2230萬，預計到2022年將達到2830萬�；疾』蚴軗p的骨組織目前對移植的骨替代品有巨大需求，是每年第二大移植組織。通常，直接使用患者或相容供體的骨組織進行骨修復。由于周圍組織供應不足，供體部位發(fā)病率和不相容性，這些治療方法僅限于較小尺寸的缺陷。為了克服這些限制，仿生支架的制造是不斷增長的關注領域。骨組織工程(BTE)策略(圖1)顯示出有希望替代更傳統(tǒng)的骨移植方法（例如自體移植或同種異體移植）來替代丟失或受損的骨組織。

圖1

幾種支架制造技術處于組織工程學（TE）的最前沿，例如靜電紡絲，冷凍干燥，生物打印和脫細胞化。結合這些制造方法，已經(jīng)為BTE選擇了廣泛的材料。該選擇通�；�于骨骼組織的功能和生物學要求，骨骼本身是由無機和天然成分組成的復合材料，以高度分層的方式組織。由于生物分子具有與生長中的細胞相互作用的固有能力和易于化學修飾的特性，最近人們的思維已從生物惰性材料轉向生物活性材料，專注于天然存在的生物聚合物。近來，衍生自脫細胞的細胞外基質(zhì)的生物材料也已用于BTE支架中。去細胞的骨細胞外基質(zhì)（ECM）保持天然的基質(zhì)結構，生長因子和細胞因子，從而增強細胞活力和生長，以進行組織修復和再生。

盡管最近對此主題進行了大量研究，但BTE的制造方法和不同生物材料的選擇仍基于假設，沒有明確的前進方向。BTE一直以往評價著眼于生物材料的主體，的制造技術，和結構設計。但是，本文的重點是評估骨棚架的制造方法，同時對高性能骨組織植入物的最佳未來制造路線提供了評論。應特別注意將支架結構/性質(zhì)/加工關系映射到生物學功能，以及如何通過同時進行的血管形成，免疫調(diào)節(jié)和成骨進展來增強臨床結果。

第一部分通常定義TE，尤其是BTE。第二部分和第三部分簡要概述了可用于BTE的多種生物材料和支架制造技術。第四部分和第五部分對骨組織工程的支架結構/性能/功能關系進行了嚴格而全面的評估，同時對高性能骨組織植入物的最佳未來發(fā)展路線提供了評論。接下來是與血管化，免疫調(diào)節(jié)和成骨有關的最新最新進展的討論。最后，我們提供了對未來的展望，同時強調(diào)了結構/屬性/功能關系在優(yōu)化BTE臨床結果中的重要性。

骨組織工程用生物材料

骨是一種高度組織化的復合材料，包含50-70％的無機成分(主要是羥基磷灰石(HAp)，20-40％的有機成分(主要是I型膠原)，5-10％的水和3％的脂質(zhì)。在宏觀上，骨骼可分為外層硬質(zhì)皮質(zhì)骨和海綿狀小梁骨。成骨細胞以類骨質(zhì)的形式促進新骨的形成，其由膠原蛋白和其他蛋白質(zhì)組成。圖2說明了這些材料在骨骼結構內(nèi)的分布情況。

圖2

材料及其降解產(chǎn)物的生物相容性也是BTE中的重要考慮因素。支架應允許細胞附著，增殖和分化，同時無細胞毒性并引起最小的免疫反應。對于BTE，生物活性涵蓋兩個主要的生物過程：i）骨傳導性和ii）骨傳導性。骨傳導性支架促進骨骼在非骨質(zhì)部位的材料表面沉積，而骨誘導性支架則利用未成熟的干細胞并將其分化方向?qū)�向成骨細胞（例如成骨細胞）�?/font>

已經(jīng)研究了多種生物材料用于骨移植支架，即無機生物材料，其中包括金屬（例如鈦及其合金）和生物陶瓷（例如磷酸鈣（例如HAp和α，β-磷酸三鈣[α，β]） ‐TCP]），碳酸鈣，生物活性玻璃和玻璃陶瓷，氧化鋁和氧化鋯）以及多種天然（例如膠原蛋白，明膠，絲蛋白[SF]，殼聚糖，透明質(zhì)酸[HA]，結冷膠[ GG]及其衍生物，藻酸鹽和合成聚合物（例如聚氨酯[PU]和聚己內(nèi)酯[PCL]）及其組合（表 1）。生物陶瓷以其出色的生物相容性，骨傳導性和生物吸收性而聞名。聚合物具有較高的機械強度和剛度，并且天然聚合物具有諸如生物相容性和ECM相似性等優(yōu)點。

表1. BTE中常用的生物材料的一般屬性

在諸如3D生物打印之類的制造過程中，或者在預制支架上播種細胞的過程中，在制造的支架中包含細胞是制造過程中的關鍵步驟。預制支架通常涂有ECM衍生的凝膠或類似ECM的凝膠，以增強生物相容性并促進細胞播種。

植入的生物材料應在植入時提供足夠的機械穩(wěn)定性，同時引起非免疫原性反應，因為生物材料會隨著天然組織的生長同時降解。生物材料還應促進附近干細胞以及成骨細胞的增殖和浸潤。生物材料的選擇取決于機械性能與天然骨組織的機械性能的接近程度。例如，皮質(zhì)骨的彈性模量為14-20 GPa，而生物活性玻璃45S5生物玻璃的彈性模量據(jù)報道為35 GPa，而PGA達到7 GPa，天然生物聚合物膠原原纖維≈35MPa。因此，BTE通常選擇具有較高剛度范圍的熱塑性聚合物和多孔生物陶瓷，因為它們可以模仿骨骼組織再生所需的承重性質(zhì)。BTE中使用的最有希望的無機生物材料，天然和合成聚合物描述如下。

2.1 無機生物材料

無機生物材料（例如金屬和生物陶瓷）已被廣泛用于修復和再生患病和受損的骨骼。這種類型的生物材料特別應用于骨移植物和水泥，骨科承重涂層（髖臼杯）和牙周修復。

鈦及其合金等金屬生物材料的特點是強度高，彈性模量低和密度低，而生物陶瓷具有出色的生物相容性，骨傳導性和耐腐蝕性。此外，生物陶瓷的壓縮強度是拉伸強度的十倍。

在生物陶瓷中，磷酸鈣（HAp和TCP）由于與天然骨骼的礦物結構相似而長期使用。TCP，無論是β還是α形式，都具有很高的吸收速率，從而形成了可吸收的網(wǎng)絡，而HAp在生理條件下是最穩(wěn)定的相。這些材料在承重應用中具有有限的機械強度，可以通過將它們與聚合物結合來克服。此外，這種陶瓷可以很容易地摻入幾種生物活性離子，信號分子和細胞。

氧化鋁和氧化鋯由于其化學生物惰性，高強度，硬度，抗裂性和耐腐蝕性，是成功用于整形外科領域的其他類型的陶瓷，尤其是用于全髖/膝關節(jié)置換術的陶瓷。通過結合氧化鋯和氧化鋁作為復合材料（稱為氧化鋯增韌氧化鋁[ZTA]），可以改善低的斷裂韌性，耐磨性，和氧化鋁陶瓷的降解的低敏感性，從而降低沖擊和位錯的危險，并提高了穩(wěn)定性。

生物活性玻璃通常用于骨骼再生，與其他生物陶瓷相比，其具有更快的結合結締組織的能力，在植入時形成無定形磷酸鈣或HAp層。此外，硅，鈣，磷，和Na離子從硅酸鹽玻璃的溶解期間釋放能刺激骨生成和新血管形成/血管生成，和酶促活性。

2.2 天然生物聚合物

天然生物聚合物與合成聚合物相比，尤其具有優(yōu)勢，因為它們與ECM具有相似性，生物相容性和生物降解性。生物聚合物主要研究了BTE是蛋白質(zhì)（例如，膠原，明膠和SF）和多糖（例如，脫乙酰殼多糖，透明質(zhì)酸，GG，和藻酸鹽）。經(jīng)常單獨或與化學修飾結合使用各種交聯(lián)策略以提供對支架剛度和結構的控制。這些將在下面的第3.3節(jié)中進一步討論。

膠原蛋白和明膠具有相似的物理性能，并因其出色的生物降解性，生物相容性和免疫原性而廣泛用于生物醫(yī)學應用。膠原蛋白是人體蛋白質(zhì)的三分之一，是骨骼組織中含量最高的聚合物。超過29種類型的膠原蛋白已被記錄下來，由于其具有組織形成和細胞生長的能力，因此被廣泛應用于組織工程。在不同類型的膠原蛋白中，I型在骨組織中最普遍，而II型主要在軟骨中發(fā)現(xiàn)。近來，源自海洋的膠原蛋白作為哺乳動物膠原蛋白的替代物也引起了人們的關注，因為它的生產(chǎn)成本低并且易于從可利用的海洋廢棄物中提取。

明膠是一種天然的水溶性蛋白質(zhì)，是通過酶處理從不溶性動物膠原蛋白中衍生而來的。明膠有兩種類型：通過酸處理產(chǎn)生的A型，和用堿性或高pH值溶液處理的B型。包含明膠的納米纖維支架主要用于大骨缺損的修復。許多原因認為明膠是BTE的合適生物材料，包括：i）生物相容性和生物降解性；ii）彈性；iii）與親本蛋白質(zhì)相比，抗原性較低；iv）優(yōu)異的細胞粘附性，和v）允許化學修飾的可及官能團。它也有凝膠的形成，乳化劑，發(fā)泡劑，和增稠劑，從膠原類型，源，和變性過程取決于容量。此外，明膠有效地與天然和合成聚合物共混，可促進支架的高生物親和力和生物力學性能。

從家蠶，桑蠶絲和非桑蠶絲以及蜘蛛獲得的蠶絲已成為組織工程學中最受研究的領域。桑蠶雙歧桿菌特別感興趣，它是一種具有半結晶結構的纖維蛋白，具有良好的機械強度和剛度，高生物相容性，彈性和緩慢的降解性。SF由兩個主要的晶體結構組成：i）由α-螺旋和β-折疊構型交替形成的絲I，和ii）屬于反平行β-折疊結構的絲II，其有助于SF的剛度和強度�；�于SF的支架的制造取決于SF的晶體/非晶結構的控制，以獲得更好的機械強度，降解性和水可加工性。

HA主要存在于結締組織和滑液中，并且具有生物降解性，生物相容性和粘彈性的特點。盡管如此，HA的機械強度有限，可以通過化學改性或交聯(lián)來解決。

殼聚糖是從所獲得的Ñ甲殼素-deacetylation，并且由d -葡糖胺（脫乙酰單元）和Ñ乙酰基d -葡糖胺（乙�；瘑卧�）隨機分布在聚合物內(nèi)，并且由β-（1-4）連接的-糖苷鍵。它具有聚電解質(zhì)和陽離子性質(zhì)，良好的生物降解性，抗血栓形成和止血作用，粘膜粘附，止痛作用和抗真菌活性。GG是水溶性的高分子胞外多糖，得自Sphingomonas elodea(原名Pseudomonas elodea)）。它具有生物相容性，熱響應性，出色的強度和穩(wěn)定性，通常用作膠凝劑。GG可以以低�；�和高�；�形式獲得，其中低酰基GG形成堅硬，非彈性和脆性的凝膠，而高�；�形式則生成柔軟，彈性和撓性的凝膠。通常在褐藻細胞壁中發(fā)現(xiàn)的藻酸鹽被視為具有吸水能力的膠凝劑和增粘劑。可通過將藻酸鹽與不同的生物活性分子結合來調(diào)節(jié)其膠凝，生物相容性，生物降解性和機械強度。

2.3 合成聚合物

使用可生物降解的合成聚合物的主要動機與它們非常高的強度和剛度有關，這是骨骼修復/再生所必需的。這種聚合物的一個關注點是它們會經(jīng)歷整體腐蝕過程，從而導致支架過早失效，甚至突然釋放酸性降解產(chǎn)物，從而引發(fā)強烈的炎癥反應。但是，可以控制分子量，化學組成和結晶度以控制降解速度。聚α羥基酸，如聚乳酸，聚乙醇酸(PGA)，聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)共聚物和聚PCL是BTE中最常用的可生物降解的聚合物，部分原因是它們具有自我增強的能力，可以最終獲得更好的強度。當與生物陶瓷結合生物可降解聚合物通常顯示較少的炎癥反應。

PLA具有熱穩(wěn)定性，細胞相容性和無毒降解產(chǎn)物的特點。它存在于不同的形式，如聚-升-丙交酯酸（PLLA）和聚- d -丙交酯酸（PDLA），其中L / d比可以以優(yōu)化的材料的降解速率進行調(diào)整。PLGA是PGA和PLA的組合，是FDA批準的聚合物，具有非常好的生物相容性，生物降解性和可調(diào)的機械性能。PCL也已獲得FDA批準用于骨修復，其特點是具有良好的溶解性，低熔點和出色的共混物相容性。與PLA和PGA相比，它具有良好的機械性能，并且易于加工。特別地，由于其緩慢的降解速度，它對于長期的可植入設備的開發(fā)非常有用。聚酯鍵的降解主要由酯鍵的非酶水解決定，因此，由于其較高的疏水性，PCL可能需要3-4年才能完全降解，而PGA的降解時間為1.5-3個月，而PLLA的降解時間為6-24個月。然而，其疏水性不利于細胞附著和滲透，可以通過與不同的生物陶瓷和生物聚合物涂層結合來解決。

2.4 無機-有機復合生物材料

無機-有機復合材料是模仿骨骼組織的好策略，而骨骼組織本身就是天然復合材料，其機械和生物學性能明顯優(yōu)于單一組分。無機材料和聚合物材料之間的最佳比例對于誘導骨組織形成，同時保持復合材料的孔隙率和機械強度至關重要。各種各樣的不同組合產(chǎn)生了對BTE具有非常好的性能的復合材料。例如，使用SF結合β-TCP呈現(xiàn)高的孔互連性，細胞附著和增殖，以及在足夠用于BTE體內(nèi)響應。另一項研究表明，雙相磷酸鈣（BCP）和膠原蛋白的結合比單獨的BCP導致更高的新骨形成。此外，該作者報告說，復合物中較高的HAp：β-TCP比例對新骨形成有積極影響。例如，無機納米顆粒也已經(jīng)被摻入到聚合物基質(zhì)中以優(yōu)化其物理和機械性能。

3種支架的制作方法

已經(jīng)開發(fā)了用于組織工程的一系列處理技術，因此，已將其應用于BTE(表 2)。理想地，最佳的制造技術可以生產(chǎn)具有可控的多層多孔結構的可重復支架，因為孔結構的幾何形狀對骨骼組織的機械和生物學反應都具有深遠的影響。如今，可以促進細胞和生長因子融合的制造技術對于創(chuàng)造最佳支架非常流行。可以肯定的是，對于特殊的臨床需求，需要先進的加工技術來促進針對患者特定植入物的高度可定制的支架幾何形狀的生產(chǎn)。生產(chǎn)骨組織支架的當前方法可包括：i）靜電紡絲，ii）冷凍干燥，iii）3D打印或增材制造（AM），iv）相分離，v）氣體發(fā)泡和vi）顆粒浸出（表 2）。這些技術中的一些可以細分為其他子類別，例如AM可以細分為熔融沉積建模（FDM），直接墨水書寫（DIW），立體光刻（SLA），數(shù)字光處理（DLP）和選擇性激光燒結（SLS）。

表2. BTE的典型制造方法的描述，特性，生物材料，孔隙率和結構/處理

未來討論三種最有希望的技術的功能和操作方法。

3.1 電紡

電紡涉及一個過程，在該過程中，由于靜電力的作用，處于粘性狀態(tài)或溶液狀態(tài)的帶電聚合物流被吸入纖維中。基本的靜電紡絲設備包括四個主要部分：i）注射泵，ii）電源，iii）金屬針以使電流進入聚合物溶液，iv）金屬收集器以收集纖維。通常通過將噴絲頭和纖維收集器連接至相對端的電端子來形成支架。端子之間的電勢差導致材料被抽出并沉積到收集器上，這有助于納米級纖維的制造。膠原蛋白和具有高孔隙率的具有高表面積的納米纖維明膠典型地通過靜電處理。

3.2 冷凍干燥

冷凍干燥或凍干是基于聚合物溶液的干燥。它可以分為三個步驟：i）溶液制備，ii）溶液的澆鑄或模制，iii）低壓冷凍和干燥。在第三步中，通過升華和解吸分別提取冰和未凍結的水。冷凍干燥能夠生產(chǎn)出孔隙率約為90％，孔徑范圍為20至200 μm的支架�？椎拇笮∮蓛鼋Y速率，聚合物濃度和溫度控制。為了生產(chǎn)具有高孔隙率和互連性的支架，需要高強度的真空。

3.3 生物打印

生物打印技術的獨特之處在于，它可以通過計算機輔助設計（CAD）軟件生成的3D數(shù)字模型創(chuàng)建復雜的，可定制的分層幾何圖形。這項新興技術能夠產(chǎn)生具有可控結構和孔隙率，可調(diào)整的結構和機械性能的幾何形狀，同時又可重現(xiàn)且具有成本效益。此外，可以將細胞，生物活性分子和/或藥物摻入結構中以產(chǎn)生更好的細胞反應。多種天然和合成聚合物，生物陶瓷及其組合已用于生產(chǎn)生物墨水，而膠原蛋白及其衍生物是最常用于充滿細胞的溶液。

生物打印可以分為以下步驟：i）預處理；ii）加工；iii）后處理。預處理是指通過計算機斷層掃描（CT）或磁共振成像（MRI）掃描對目標組織的解剖結構進行成像，并將這些圖像轉換為切片的3D模型。加工步驟涵蓋了生物打印組織生產(chǎn)中涉及的所有內(nèi)容，即生物墨水的開發(fā)和支架的制造。后處理是指生物打印組織的成熟直至適合于體內(nèi)使用，通常發(fā)生在生物反應器中。

對于可印刷的生物墨水，應考慮幾個要求，例如流變行為（粘度和剪切稀化），表面張力，溶脹，膠凝動力學和材料的機械性能。另一個重要的方面是在加工和后加工步驟中生物墨水的交聯(lián)（物理，化學或酶促），以保持印刷結構的生物力學穩(wěn)定性。物理交聯(lián)取決于溫度和分子相互作用以產(chǎn)生非共價鍵和有機自由基物質(zhì)。物理交聯(lián)的例子是使用二價離子（例如，Ca 2 +，Ba 2+和Mg 2+）來交聯(lián)藻酸鹽。化學交聯(lián)是由聚合物鏈之間的共價鍵的形成而獲得，并且更穩(wěn)定，比物理交聯(lián)更強。戊二醛（GTA），1-乙基-3- [3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDGE）是最常見的聚合物官能團交聯(lián)劑（例如， COOH， OH，或 NH 2）。酶促交聯(lián)還可以促進基于蛋白質(zhì)的聚合物之間的共價鍵合，并在生理條件下快速膠凝（不超過10分鐘）。多種酶已用于原位凝膠化，例如轉谷氨酰胺酶，分選酶，賴氨酰氧化酶，血漿胺氧化酶，磷酸泛肽基轉移酶，磷酸酶，β-內(nèi)酰胺酶，嗜熱菌素和過氧化物酶。其中，辣根過氧化物酶（HRP）具有用于生物醫(yī)學領域中特別關注，因為它的快速凝膠化和可控的交聯(lián)密度。HRP在氧化劑（例如過氧化氫(H 2 O 2))存在下催化苯胺，苯酚和酪胺的偶聯(lián)。一個例子是HRP / H 2 O 2當與彈性蛋白結合時，SF的交聯(lián)被提議作為用于水凝膠生物打印的快速固化生物墨水。生物聚合物的甲基丙烯酸酯化是另一種廣泛應用于定制其機械和生物功能性的化學修飾。例如，在光引發(fā)劑的存在下，明膠與甲基丙烯酸酐的反應衍生出甲基丙烯酸明膠（GelMA）。

在基于支架的（自上而下的方法）生物打印中，將打印外源性生物材料基質(zhì)（例如水凝膠），并將細胞接種或作為生物墨水的一部分進行打印。自上而下的打印方法通常用于骨骼組織，因為它們很可能實現(xiàn)骨骼所需的結構和機械性能。SLA，SLS和FDM是BTE中使用最普遍的生物打印形式。為了克服諸如細胞接種效率低和細胞分布不足的挑戰(zhàn)，經(jīng)常使用將再生細胞封裝在外部基質(zhì)內(nèi)的仿生水凝膠。這些水凝膠已顯示出滿足細胞活力，細胞錨定，細胞遞送以及持續(xù)釋放生長因子的化學線索的需求的有前途的能力。細胞印刷通常采用無支架（自下而上）的方法，該方法依靠細胞聚集體通過自主自組裝融合在一起。用于細胞打印的技術包括基于液滴的生物打�。ㄟm用于DIW），基于擠出的生物打印（適用于FDM）和激光輔助生物打印。當前的生物打印技術主要由單組分生物墨水主導，這種墨水通常在細胞活力和打印機可加工性之間缺乏可接受的折衷。這些技術不適用于印刷大型骨支架，但不適用于具有高細胞密度的較小組織。有趣的是，已經(jīng)探索出混合方法，該方法在同時解決機械和生物學功能方面顯示出可喜的成就。

3.4 脫細胞

脫細胞骨基質(zhì)（DBM）已廣泛用于BTE中，作為支架和生物制造用生物墨水，旨在模仿天然骨微環(huán)境。去細胞化包括從組織中去除所有細胞，同時保留天然ECM組成及其結構完整性，以及促進細胞生長和分化的能力。獲得DBM的加工技術包括表面活性劑和酶促方法（例如乙二胺四乙酸與胰蛋白酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）與氫氧化銨，Triton X-100和脫氧膽酸鈉以及核酸酶和蛋白酶的組合），以及熱沖擊，超聲處理和靜水壓力。后者的優(yōu)點是無有害化學物質(zhì)的使用和蛋白質(zhì)變性的最小化，因此可以保留高水平的ECM含量。最終步驟涉及使用核酸酶和脫水酒精徹底清除細胞殘留物。通過測量DNA含量和細胞核染色可確認脫細胞作用。

基于DBM的支架可以單獨使用DBM制成，也可以與多種聚合物和生物陶瓷組合使用，以增強其機械性能，成骨作用和血管形成潛力。

骨組織工程中的支架結構/功能特性

骨組織結構是BTE中的關鍵特征，因為結構會影響機械性能和生物學響應。在執(zhí)行天然骨骼的承重功能時，支架還應促進血管形成。支架的互連多孔結構（圖 3）允許天然細胞遷移和增殖。此外，最佳設計應為細胞-支架相互作用提供足夠的表面積，同時促進氧氣和營養(yǎng)物的擴散以及廢物的排出。

圖3

通常，需要孔徑≥300μm以促進新的骨形成和血管形成，而可接受的最小尺寸為≈100μm。由于提供足夠的氧氣和營養(yǎng)供應空間，較大的孔徑被證明是骨骼生長的最佳選擇，這進一步促進了新骨組織中的血管形成。通常，BTE支架的孔徑在50至> 900 μm的范圍內(nèi)。已顯示大孔可通過介導血管形成來促進骨誘導性。但是，小于100 μm的孔徑可能會阻止血管生成。550 μm的平均孔徑已被證明是最理想的骨形成方法，而分層的多孔結構已被證明可以增強生物學特性。滲流理論，如圖3A所示 ，用于計算可以穿越支架相互連接的孔的最大示蹤劑的直徑。滲濾直徑對于理解支架的互連至關重要，因為它限制了可以通過支架的細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的大小。在另一側，瓶頸尺寸由圖3B中的括號指示 ，描述孔之間連接的直徑。一項體內(nèi)研究表明，骨替代物的最佳孔/瓶頸尺寸為700-1200 μm，因此可以通過印刷技術進行控制。

組織工程化的骨骼需要具有足夠的抗壓強度以支撐體重。通常，小梁骨和皮質(zhì)骨的壓縮模量分別高達2.0 GPa和14-18 GPa。另一方面，制成的支架的彈性模量也必須足夠高，以在體內(nèi)維持其結構并促進細胞生長。支架的降解率必須與天然ECM的增長相匹配，以確保在支架的整個生命周期中都具有機械支撐。這在很大程度上取決于流體的進入速率，而流體的進入速率又是孔隙率的函數(shù)。因此，增加的孔隙率以降低的機械性能為代價，對支架的降解產(chǎn)生了積極的影響。骨組織支架的孔隙率與抗壓強度之間的典型反比關系如圖 4所示。孔的互連性，孔徑形狀在制造用于骨組織修復的理想支架中起著重要作用�？紤]到組織修復率會隨著年齡的增長而降低，因此應仔細考慮支架的結構設計和材料選擇。

圖4

生物打印的骨支架可以制造具有受控的物理和機械性能的工程組織，可以結合多種生物墨水的打印以及在不同的層和漸變中進行打印。例如，機械強度高的“松質(zhì)骨狀”可印刷植入物，含有包封在PLGA微粒干細胞和編程因子控釋，幫助的新穎局部遞送策略的發(fā)展直接用于骨細胞行為修理。

關于基于dECM的BTE支架的使用，已經(jīng)報道了具有指導性生物分子且免疫反應降低的理想微環(huán)境。例如，體外研究表明，培養(yǎng)21天后，大鼠BMSC在PCL /脫細胞牛小腸粘膜下層/ HAp多層支架上沿成骨細胞譜系增殖和分化，同時保持了機械性能。與這些研究平行的是，基于dBM的支架的生物打印已受到相當多的關注，表明精確的孔徑和微孔可以調(diào)節(jié)血管的浸潤，從而導致新的骨形成以及增強的機械穩(wěn)定性。

骨骼組織工程中的5種支架結構/加工關系

結構的控制最終控制了機械性能，并在較小程度上控制了生物學響應。因此，評估哪種制造方法可以提供對結構的最大控制以模仿天然組織至關重要。盡管支架結構的關鍵方面（包括孔徑，形狀，方向和互連性）是通過加工方法的空間分辨率和幾何控制直接確定的，但它們卻受到加工時間，交聯(lián)機制和熱降解的間接影響。例如，膠凝速率對于設定合適的印刷速度至關重要，以確保在整個加工過程和后加工過程中保持支架的剛度，因此需要在印刷之前通過檢查其化學，物理或酶促交聯(lián)機理來分析生物墨水的膠凝。

而表 2提供了對當前最先進制造技術的洞察力，這并不一定為以下問題提供簡單的答案-哪種技術將成為BTE的主導？例如，空間分辨率本質(zhì)上與機械和生物學特性相關聯(lián)，因此是關鍵因素，但這需要在特定背景下加以考慮。與增材制造方法相比，可通過噴墨生物打印適用于大型骨骼構造的陶瓷支架獲得更高的分辨率（約15 μm），但是該技術因其與細胞印刷不兼容而受到限制。另一個例子是，皮質(zhì)骨的孔隙率通常僅為5-10％，而松質(zhì)骨的孔隙率則為50-90％，因此，適用的技術必須促進在這些范圍內(nèi)產(chǎn)生孔隙。

迄今為止，尚無加工技術能夠構建與天然骨組織相同的體系結構，但是隨著先進醫(yī)療材料的發(fā)展，這種技術將發(fā)生改變，這種材料可促進微擠壓而不會堵塞噴嘴，從而提供高水平的空間分辨率。其他加工問題和局限性可能會通過結合技術來解決，例如AM，可以與顆粒浸出或冷凍干燥相結合，以克服基于材料或結構的局限性。

5.1 臨床試驗

值得注意的是，尚未為BTE建立最佳的生物材料，因此跨制造技術的比較仍然缺乏跨最佳骨組織材料進行類似比較的優(yōu)點。迄今為止，有限的骨組織支架已經(jīng)進入臨床應用，盡管這未能提供對結構-加工關系的關鍵見解，但它為選擇最佳材料提供了有意義的背景。Zeng等綜述了修復骨缺損的臨床試驗研究，其中八種使用天然支架（膠原蛋白和明膠），十二種使用合成支架。據(jù)報道，將支架與骨刺激劑結合使用可加速骨愈合，其中HAp /膠原蛋白顯示出最高的骨再生水平。在少數(shù)臨床可用產(chǎn)品中，由天然生物聚合物（膠原蛋白和明膠）以及無機添加劑（例如TCP和HAp）組成的復合材料往往會主導市場。

5.2 層次結構

如圖 5所示，由于骨骼再生是通過細胞和支架的協(xié)同作用進行的，因此BTE中的許多研究都采用了模仿骨骼組織的分層孔結構的策略。使用間接3D打印和冷凍干燥的組合方法，創(chuàng)建了由SF和生物活性玻璃組成的分層3D生物活性支架，該支架表現(xiàn)出兩個級別的孔，分別為500–600和10–50 μm。這產(chǎn)生了極好的機械穩(wěn)定性和柔韌性，分層多孔支架在潮濕條件下壓縮加載后沒有任何波動。此外，與普通SF支架相比，生物復合支架促進了人類骨髓干細胞的附著以及堿性磷酸酶（ALP）活性，從而突出了BTE應用中分層結構的希望。

圖5

更好地模仿天然骨組織的復雜形態(tài)傾向于具有更大的機械性能。例如，PCL/ PLGA支架對于不同的支架形態(tài)表現(xiàn)出不同的楊氏模量：對角線（9.81 MPa），交錯（7.43 MPa）和晶格（6.05 MPa）。較少報道的結構特征是孔定向，該特征對機械性能具有明顯和可測量的影響。已對通過順序單向冷凍制備的殼聚糖和明膠（B型）支架進行了檢查。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于孔隙取向，壓縮模量，拉伸模量和剪切模量都顯示出相同的趨勢，即垂直>隨機取向>水平。這進一步增加了對加工技術的推測，該加工技術可以產(chǎn)生具有與天然骨組織的取向?qū)�準的受控的孔取向的支架。這些工作集中于將AM與其他傳統(tǒng)的組織工程方法（例如氣體發(fā)泡）相結合，這些方法表明可以同時實現(xiàn)孔隙率和幾何控制。

Kim等使用3D打印和鹽浸相結合的方法，制造了孔徑（宏觀和微觀）不同的磷酸鎂（MgP）陶瓷支架，并研究了兔顱蓋模型的體內(nèi)反應。創(chuàng)建了三種類型的支架，所有支架都存在大孔（> 100 um），但微孔水平不同（圖 6A）。含有微孔的MgP支架顯示出較高孔隙率的層狀形態(tài)（圖 6B），與MgP0（圖6C）相比，它促進了更快的生物降解，似乎增強了骨骼的形成和重塑活動 。

圖6

劉等報告了在成年兔的血管形成不同的孔的水平，使用聚（3-羥基丁酸酯的沖擊共-3-羥基己酸酯）（PHBHHx）支架制造由合并的溶劑澆鑄和顆粒瀝濾方法。雖然先前的研究主要是從宏觀和微觀的角度研究多孔結構，但Liu等人。證明了介孔材料（2-50 nm）具有以下能力：i）刺激HAp的形成，ii）促進成骨細胞的增殖和分化，iii）增強骨基質(zhì)界面強度。此外，介孔材料的加入有利于傳遞生長因子，例如BMP-2，并促進血管生成，從而進一步增強了骨的再生，如圖7所示。

圖7

盡管本綜述中介紹的大多數(shù)制造技術都能夠產(chǎn)生微孔和大孔的組合，但仍需要提高空間分辨率和精度才能始終如一地產(chǎn)生高度受控的中孔。鄭等。演示了近凈成形制造方法金屬注射成型（MIM）在鈦植入物制造中的應用。這有助于精確表示天然骨組織的多孔結構，直至中孔水平，并且已證明在體內(nèi)成骨犬模型中是有益的。盡管用于長期植入的作為生物穩(wěn)定和生物惰性材料的鈦在本次審查中超出了范圍，但該制造技術仍可提供對BTE中精確控制結構的好處的見解。

改善骨骼組織工程中支架血管化的6種先進策略

血管化是BTE中最關鍵的挑戰(zhàn)，因為組織厚度限制了營養(yǎng)和氧氣擴散，這是在骨愈合和再生過程中支持骨整合和成骨作用所必需的（圖 8）。眾所周知，血管生成會影響成骨，在新的骨形成過程中，特別是在臨界尺寸的缺損中，骨祖細胞和成骨細胞靠近血管內(nèi)皮細胞。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管生長的主要生長因子，在骨骼修復/再生過程中需要有效地將血管生成與成骨結合起來。

圖8

已經(jīng)探索了在工程支架中開發(fā)合適的血管網(wǎng)絡的各種策略，即：i）在支架設計中使用生物相容性材料；ii）如第5節(jié)所述，支架的微納結構，形態(tài)，孔隙率和粗糙度 ；iii）離子摻雜材料；iv）添加血管生成生長因子（例如，VEGF和成纖維細胞生長因子（FGF））或重組蛋白；v）在靜態(tài)和動態(tài)條件下共培養(yǎng)細胞系統(tǒng)（表 3）。

                                                                                                表3. BTE的血管化策略

圖9

據(jù)報道，使用低溫3D打印技術制造包含水/ PLGA /二氯甲烷（DCM）乳狀油墨支架的β-TCP和成骨肽（OP）作為BTE的血管化方法。然后將支架涂上含有I型膠原水凝膠的血管生成肽（AP），以確保血管生成能力（圖 10A）。培養(yǎng)3天后，使用接種在支架上的大鼠內(nèi)皮細胞（EC）進行的體外血管生成測試顯示，活細胞的存活率為98％（圖 10B - a，b）。還觀察到在含有AP，支架的提取物增強的EC遷移，由于其快速釋放（圖 10B -c，d）。

圖10

涉及在材料中摻入生物活性離子（例如，Mg，Ce和Cu）的策略導致血管生成和成骨標記物水平增加。Gu等。制備了摻有Mg的β-TCP支架，該支架與人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）培養(yǎng)，以實現(xiàn)骨形成和良好的血管形成潛力。此外，馬等。報道了摻鎂的3D打印鉭支架上血管化骨形成的顯著改善。另一種報道的方法是將Ce納米顆粒摻入通過電紡絲獲得的PLLA /明膠復合支架中。小雞胚胎絨膜尿囊膜（CAM）作為用于血管生成評估的體內(nèi)模型系統(tǒng)顯示，當用VEFG治療時，胚胎血管顯著增加。傳遞在血管生成和成骨中起關鍵作用的生物活性離子的另一種方法是使用生物活性玻璃生物材料支架。在網(wǎng)絡溶解過程中，生物玻璃化學結構中存在的離子的釋放可以激活與血管形成和骨形成相關的不同基因。

血管生成細胞與多能干細胞的共培養(yǎng)對新血管的形成和成骨具有積極作用，這是另一種血管形成策略。例如，He等人。觀察到，ASC /內(nèi)皮祖細胞（EPC）共培養(yǎng)系統(tǒng)與HAp支架相結合可顯著促進臨界尺寸骨缺損的再生和血管生成。在Honda等人的一項研究中，在HUVEC和MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)的條件下，結合結締組織生長因子（CTGF）的HAp纖維支架通過刺激血管生成而增強了成骨作用。Thrivikraman等。開發(fā)了一種充滿細胞的膠原蛋白水凝膠，封裝了HUVECS和BMSC的共培養(yǎng)物，能夠刺激hMSC的成骨分化，同時能夠在體外和體內(nèi)形成hMSC支持的血管毛細血管。Markou等。使用嵌入膠原蛋白/纖維蛋白原/纖連蛋白水凝膠中的內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞和周細胞（血管類器官）制造血管化組織，可用作體外萌發(fā)的毛細血管狀結構的起點和快速創(chuàng)建功能性血管網(wǎng)絡體內(nèi)。

使用PCL納米纖維（NFM）設計了另一種旨在復制自體血管化BTE的策略，該PCL納米纖維的表面包含結合的內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和VEGF。Chick CAM體內(nèi)試驗顯示，植入7天后，在含有內(nèi)源性VEGF（VEGF和BMP2 | VEGF）的系統(tǒng)中形成具有高度分支的毛細血管網(wǎng)的高度成熟的血管（圖 11）。

圖11

骨組織工程中的7種免疫調(diào)節(jié)支架

具有調(diào)節(jié)具有免疫調(diào)節(jié)特性的宿主對支架免疫應答能力的支架可以在不同程度上利用再生潛能。免疫細胞的激活在調(diào)節(jié)病理狀態(tài)下骨骼重建和吸收的平衡方面很重要。在免疫細胞中，巨噬細胞負責吞噬和募集其他在組織愈合過程中至關重要的細胞。

生物材料的物理化學特性，例如形狀，大小，孔隙率和化學功能性，以及生物材料的類型，可以刺激免疫或炎癥途徑，并最終促進新骨的形成。Wang等。制備的摻有鑭（La）的磁性鑭（HA）納米粒子/殼聚糖支架（MLaHA/CS）能夠募集大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSC）并通過巨噬細胞極化調(diào)節(jié)宿主對支架的免疫反應，以實現(xiàn)骨骼再生。支架呈現(xiàn)出具有板狀納米粒子的相互連接的大孔，寬約50-150 nm，厚約30 nm。觀察到磁性納米粒子和La摻雜劑可以抑制巨噬細胞向M1的分化，從而降低炎癥反應并促進M2巨噬細胞極化，從而為骨修復提供促進再生的微環(huán)境(圖 12A))。與其他組合物相比，在大鼠顱骨缺損模式下進行的體內(nèi)測試顯示，MLaHA / CS組的新骨形成高（圖 12B）。

圖12

另一個有趣的方法是使用基于CaPs的生物材料來觸發(fā)所需的免疫反應并增強骨骼愈合，這主要歸因于CaPs的骨傳導能力。此外，所述帽結構特征可強烈影響特定細胞應答。例如，納米級缺鈣HAp（CDHA）可以刺激成骨，而高孔隙度可以正向調(diào)節(jié)其炎癥能力。此外，將CaP與MSC結合可以突出宿主免疫系統(tǒng)對骨骼再生的主要作用。另一方面，與CDHA生物材料相比，接種巨噬細胞的β-TCP表現(xiàn)出減少的促炎細胞因子。最近，有人提出了一種支架策略，該策略包括用能夠調(diào)節(jié)骨骼生物學反應的生物活性離子功能化的β-TCP。例如，由β-TCP的生物復合材料摻雜有錳2+，鋅2+，和/或Sr 2+結合SF根據(jù)特定離子摻雜劑呈現(xiàn)生物反應。而Sr 2+和Mn 2+摻雜顯示出高成骨性，摻雜Zn 2+的支架增強了細胞增殖，因此顯示出促進免疫調(diào)節(jié)的能力。

結論和未來展望

顯然，傳統(tǒng)的和最先進的組織工程手段在BTE中都具有潛力。最佳的制造方法必須能夠生產(chǎn)能夠滿足所需組織特征（即結構穩(wěn)定性-孔隙度，孔徑和孔隙互連性，機械性能，生物相容性，骨電導/骨誘導性和血管生成潛力）的復合支架。仍然是一個挑戰(zhàn)。僅注意這些關鍵特性和制造方法之間的關系，才有可能開發(fā)出具有與天然骨組織相同的分層結構的合適生物材料。

盡管適應和實現(xiàn)用于BTE的臨床翻譯的支架制造技術仍然是一個主要挑戰(zhàn)，但臨床上使用的支架數(shù)量非常有限。由于骨組織的復雜復合性質(zhì)，使用單一材料的支架制造方法可能不會在BTE中占據(jù)領先地位。由于支架的結構特征嚴重影響機械和生物學性能，因此具有隨機孔取向和缺乏孔控制的加工將不適用于要求苛刻的應用，例如大骨置換。此外，現(xiàn)在清楚的是，將受控的分層孔結構與定義的孔形狀的互連孔網(wǎng)絡相結合對于骨組織的制造至關重要。所以，磁共振成像（MRI），計算機斷層掃描（CT）和微型CT掃描技術的進步導致了患者特定結構信息的可能性，這些信息可以反饋到支架設計環(huán)中并用于監(jiān)測術后結構變化。通常，基于AM的技術能夠通過利用數(shù)字孿生子（CAD模型）緊密生成所需的支架架構。當前，跨其他技術的結構和分辨率缺陷歸因于硬件內(nèi)的物理限制。

盡管這種方法對于諸如靜電紡絲這樣的技術仍然是新穎的，但它突出了基于AM的方法的基本原理的好處。但是，在復雜的基于過程的相互作用中控制纖維直徑，例如攪動幅度，靜電力，此外，將CAD與統(tǒng)計技術和有限元分析（FEA）結合使用可以進一步了解結構與機械性能之間的關系。雖然基于擠壓的增材制造系統(tǒng)最有可能復制具有預定義內(nèi)部幾何形狀的結構，但由于系統(tǒng)的物理限制（例如，噴嘴直徑和運動控制），它們速度慢且打印分辨率差�？朔�這些局限性對于BTE的發(fā)展至關重要，候選方法可能將包括技術組合。細胞活力和營養(yǎng)素在整個結構中的灌注將需要新的生物墨水，而微載體的摻入將顯示出希望�；�于聚合的制造方法（例如SLA）可以克服分辨率和速度問題；然而，在考慮本文概述的特性的同時，必須開發(fā)新材料。在支架制造中使用的不同生物材料的集合中，聚合物和無機材料的組合被認為是最有前途的。這些復合材料具有更好的強度，足夠的生物降解性和免疫反應。

簡而言之，要創(chuàng)建模仿天然ECM的骨組織，就需要在結構處理關系與同時進行的材料開發(fā)方面做出進一步的努力。由于提到的有關不同制造技術的固有局限性，組合策略提供了潛力。增材制造技術與最新的醫(yī)學成像技術相結合，在未來幾年中具有巨大的潛力，可以將特定于患者的解決方案從實驗室?guī)У酱策�，同時提高患者的治療效果。

關于BTE中血管化和免疫調(diào)節(jié)的巨大挑戰(zhàn)，已成功報道了幾種誘導血管生成和成骨的方法。然而，組織工程化的血管化骨移植物在臨床中的有效應用是非常有限的。應注意正確理解生長因子釋放的動力學和局部生物力學環(huán)境。在這種情況下，支架開發(fā)過程中的工程梯度可以為BTE開辟新的可能性。

最后，應考慮采用具有免疫調(diào)節(jié)特性的仿生支架設計，以增強原位骨再生以改善臨床效果。

參考文獻

https://doi.org/10.1002/adfm.202010609（點擊文末閱讀原文查看英文原文）

文章來源：微信公眾號  上普生物