【解析】構(gòu)建骨組織工程支架中應(yīng)用的3D打印技術(shù)

骨具有強大的自我修復(fù)的能力，但無法完全修復(fù)大體積的骨缺損。全世界每年骨缺損的患者數(shù)以千萬計，因腫瘤和創(chuàng)傷而造成的大體積骨缺損是臨床上進(jìn)行骨修復(fù)和移植的主要原因。治療骨缺損最理想的材料就是自體骨，但是自體骨來源有限，同時增加了患者的痛苦，不能滿足臨床需要。骨組織工程的出現(xiàn)，為這一難題提出了新思路。骨組織工程基本出發(fā)點是以“誘導(dǎo)成骨”的方式而非單純以“爬行替代”的方式實現(xiàn)骨的修復(fù)和再生。近年來，隨著骨組織工程的研究深入，支架材料的制備以及其制備的方法也成為研究重點。  

骨組織工程支架的傳統(tǒng)制備方法包括溶液澆鑄/離子洗出法、原位成型法、靜電紡絲法、相分離/凍干法、氣體成孔法等，雖然這些工藝也獲得了但比較滿意的效果，但不能實現(xiàn)對支架材料和孔隙結(jié)構(gòu)的精確控制，結(jié)構(gòu)形狀也無法做到與骨缺損部位的解剖結(jié)構(gòu)完全契合，從而不能實現(xiàn)個性化植入物的制備。  

3D打印技術(shù)的出現(xiàn)，有效地彌補了這些不足，迅速在骨組織工程支架成型中得到廣泛應(yīng)用。3D打印技術(shù)為快速成型技術(shù)的一種，是一種基于三維數(shù)字模型，應(yīng)用粉末狀或液體的金屬或塑料等可黏合材料，通過逐層打印方式來構(gòu)造實物的技術(shù)。由于其無需模具，可直接根據(jù)計算機三維圖形數(shù)據(jù)“打印”出任何形狀物品，甚至能夠控制所打印物品內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)，這使3D打印技術(shù)在構(gòu)建骨組織工程支架的優(yōu)勢得以體現(xiàn)。雖然3D打印技術(shù)應(yīng)用于骨組織工程支架的構(gòu)建具有很多優(yōu)勢，但仍處于起步階段，應(yīng)用于臨床扔面臨很多挑戰(zhàn)。  本篇綜述主要包括4個部分，分別為骨組織工程支架、骨組織工程支架中的3D打印技術(shù)、用于3D打印構(gòu)造骨組織工程支架的材料和討論。   

1  資料和方法
1.1  資料來源  
第一作者應(yīng)用計算機檢索1990年1月至2015年2月MEDLINE數(shù)據(jù)庫、Science Direct數(shù)據(jù)庫、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、維普中文期刊網(wǎng)等有關(guān)3D打印技術(shù)在構(gòu)建骨組織工程支架中應(yīng)用的文章，英文檢索詞“three-dimensional printing， tissue engineering，rapid prototyping technology，scaffold， materials ”， 中文檢索詞“3D打印、組織工程學(xué)、快速成型技術(shù)， 支架、材料”，排除重復(fù)性研究。共檢索到52篇相關(guān)文獻(xiàn)，其中外文文獻(xiàn)40篇，中文文獻(xiàn)12篇。

1.2  納入和排除標(biāo)準(zhǔn)  
納入標(biāo)準(zhǔn)：
①文章所述內(nèi)容需為骨組織工程支架構(gòu) 建的論著或綜述類文章，以及與3D打印技術(shù)領(lǐng)域研究成果相關(guān)的文章。
②同一領(lǐng)域選擇近期發(fā)表或在權(quán)威雜志上發(fā)表的文章。
③文章述及3D打印技術(shù)應(yīng)用于支架構(gòu)建及兩者之間的關(guān)系，闡述其特點及優(yōu)越性并提供充足的理由。
④在涉及材料對比與選擇實驗的文章中，選擇設(shè)計合理、干預(yù)和對照的措施明確的實驗設(shè)計文章。  
排除標(biāo)準(zhǔn)：
①重復(fù)性研究。
②實驗設(shè)計不合理的文 章。  

1.3  數(shù)據(jù)的提取  
計算機初檢得到52篇文獻(xiàn)，閱讀標(biāo)題和摘要初篩，排除中英文文獻(xiàn)重復(fù)報道的內(nèi)容，及與3D打印或骨組織工程支架不相關(guān)的內(nèi)容。  

2  結(jié)果
2.1  納入資料基本概況  
符合納入標(biāo)準(zhǔn)的33篇文獻(xiàn)中，文獻(xiàn)是關(guān)于骨缺損治療相關(guān)報道，文獻(xiàn)是有關(guān)傳統(tǒng)支架制備方法的相關(guān)報道，文獻(xiàn)是關(guān)于支架所需具備的條件相關(guān)報道，文獻(xiàn)是關(guān)于3D 打印技術(shù)優(yōu)勢及要求的相關(guān)報道，文獻(xiàn)是關(guān)于不同材料的特性及應(yīng)用進(jìn)展的相關(guān)報道，文獻(xiàn)是有關(guān)3D存在局限性與未來發(fā)展方向的相關(guān)報道。

2.2  納入資料的研究結(jié)果特征   
2.2.1  骨組織工程支架  
在骨組織工程的3個基本要素中(種子細(xì)胞、支架材料和生長因子)，支架材料無疑有著舉足輕重的作用，因為一方面，它是信號分子或靶細(xì)胞載體，另一方面，它還提供了新骨生長的支架[8]。  在骨組織工程中，理想的支架材料應(yīng)具有以下條件：
①骨傳導(dǎo)性：材料能為新組織的生長提供通道或媒介的能力。
②骨誘導(dǎo)性：材料可以刺激骨組織的生長。
③良好的生物相容性：材料能促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附和增殖分化。
④良好的生物降解性。
⑤足夠的力學(xué)性能。
⑥三維多孔結(jié)構(gòu)，能為種子細(xì)胞的生長提供空間。
⑦較易加工和消毒性能等。

而對于支架的設(shè)計，需考慮以下3個方面：
①能為細(xì)胞提供黏附、分化、增殖或遷移的基礎(chǔ)，支架的孔徑尺寸及結(jié)構(gòu)、孔隙率以及表面化學(xué)性質(zhì)是影響因素。
②合適的力學(xué)強度。
③符合取代部位的解剖學(xué)形態(tài)。

圖1  3D打印基本流程

圖注：圖中A，B為第1和第2步：滾軸將薄薄一層原料粉末鋪在工作臺上；C為第3步：噴頭將含有黏結(jié)劑的液滴局部噴在粉末床上， 黏結(jié)劑周圍的粉末與黏結(jié)劑結(jié)合，使噴過黏結(jié)劑周圍的粉末局部凝固，構(gòu)成最終成品三維結(jié)構(gòu)的一小部分；D為第4步：鋪有原料粉末的 活塞上升，而鋪有樣品粉末的活塞下降，開始鋪新的一層粉末(重復(fù)第2步)，如此反復(fù)，直到完整的3D結(jié)構(gòu)被打印完全。

另外，普遍認(rèn)為3D骨支架孔隙率應(yīng)大于40%-60%以利于細(xì)胞快速擴散和細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的流動，同時有利于細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。所以設(shè)計與制備支架時需注意與重視骨組織工程支架的要求，選擇最恰當(dāng)?shù)姆椒ㄅc材料。  

2.2.2  骨組織工程支架中的3D打印技術(shù)  
3D打印技術(shù)概況：3D打印技術(shù)是最早于1989年由麻省理工學(xué)院的Emanual Sachs等報道，是一種按需噴射的微滴噴射技術(shù)。3D打印系統(tǒng)是在廉價的商用打印機系統(tǒng)上加以改進(jìn)，增加z軸的運動控制系統(tǒng)，采用系統(tǒng)原有的噴墨裝置或經(jīng)過改裝的注射器陣列實現(xiàn)材料的離散形成。利用這種技術(shù)在制備骨組織工程支架時，一般通過打印機將儲存于其中的具有骨修復(fù)功能的粉末材料和黏結(jié)劑逐層打印出模型結(jié)構(gòu)，黏結(jié)劑用于將粉末粒子之間和層與層之間黏結(jié)，使其更加穩(wěn)固，最終可形成所需要的骨組織工程三維支架材料。打印材料的微觀結(jié)構(gòu)可以通過很多參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如改變黏結(jié)劑的流速，打印的速度及沉積位置等。  

3D打印技術(shù)相較于其他快速成型技術(shù)，具有的優(yōu)勢有：
①高精度：即高分辨率。
②可以同時打印種子細(xì)胞和支架材料，更利于整體三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。
③構(gòu)建速度快。
④可按需構(gòu)建模型，實現(xiàn)個性化需求。
⑤可根據(jù)需 要設(shè)定特定的孔隙率、交聯(lián)，可顯著提高支架的生物學(xué)及力學(xué)性能從而促進(jìn)骨組織生長及骨折愈合。另外，從材料的角度來說，幾乎所有種類的粉末只要能夠與黏結(jié)劑結(jié)合都可以被用來打印。  

3D打印的可伸縮性又使得所打印物品的大小可以從幾毫米到幾米。這些特性大大增加了3D打印使用的自由度[14]。這些優(yōu)點為3D打印技術(shù)應(yīng)用于骨組織工程支架構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)，也成為投入大量研究于此方法的意義所在。   3D打印技術(shù)基本流程：簡單概括為：鋪撒粉末、單層印刷、活塞下降、往復(fù)運動和印刷形成5個階段，基本流程如圖1所示。  

3D打印應(yīng)用于支架構(gòu)造的要求：3D打印應(yīng)用于支架構(gòu)造時，所用粉末和黏合劑需具備一定的條件。粉末要具有一定的流動性、穩(wěn)定性和可濕性。而粉末與黏合劑之間的反應(yīng)性在3D打印中也起到重要作用。

⑴流動性：所用粉末材料要具有一定的流動性。良好的流動性可以保證滾軸可將粉末鋪成薄薄的一層，同時也利于最終除去多余的粉末。另外，良好的流動性提供了高分辨率的打印效果，也成為3D打印高精度特性的深層原因之一。  流動性主要取決于粒子大小和形狀，粒子越小、形狀越類似球形，則流動性越大。有研究證實分辨率至少是粒子大小的2倍，所以高精度的打印效果依賴于選擇細(xì)小的粉末。然而，過小的粉末由于內(nèi)部特殊作用力的原因容易結(jié)塊，導(dǎo)致流動性減低。所以在流動性與分辨率之間必須找一個平衡點。  

⑵穩(wěn)定性：粉末的穩(wěn)定性在噴黏結(jié)劑時尤其重要。當(dāng)噴頭噴黏結(jié)劑時，體積大約30 pL的液滴以6 m/s的速度沖擊松散的粉末床，這樣會形成類似彈道的一個凹陷，底部是液滴。速度每增加1 m/s，則受影響的范圍直徑增加5-10 μm。  當(dāng)重新涂布時，最上面一層收到剪切力的影響，很有可能造成所打印出的薄層結(jié)構(gòu)移位，影響最終成品的準(zhǔn)確度和完整性。除了此種橫向移位，由重力所產(chǎn)生的壓縮負(fù)荷會使所打印出薄層結(jié)構(gòu)的縱向位移。因此，提高穩(wěn)定性、避免這些影響可以從提高黏合強度入手，如添加少量水或者增加粉末床的堆積密度。  

⑶可濕性：粉末的可濕性是另一項重要的要求，它直接影響了打印精確程度和三維結(jié)構(gòu)的原始強度。但太強的可濕性又造成黏結(jié)劑擴散范圍太大，降低了打印分辨率。而太弱的可濕性則會由于太大的接觸角或黏結(jié)劑的高黏度而造成相鄰層之間的錯位，最終降低機械完整性。  粉末的可濕性取決于多種因素，包括粉末與黏結(jié)劑的接觸角、黏結(jié)劑噴射速度、粉末床表面的形勢以及粉末與黏結(jié)劑之間的化學(xué)作用等。目前很難得到可靠的數(shù)據(jù)來定量分析物體的接觸角，尤其對于粉末更加困難。雖然有一些方法用來研究粒子與黏結(jié)劑之間的相互作用，如動力學(xué)液滴形狀分析，毛細(xì)上升方法，粒子流動的方法，但仍處于初級階段，理解尚淺。  

⑷反應(yīng)性：粉末與黏結(jié)劑的反應(yīng)性在3D打印中也起到重要作用。太高的反應(yīng)性會限制黏結(jié)劑的擴散，而低反應(yīng)性需黏結(jié)劑涂布更加集中。所以反應(yīng)性能夠影響層與層之間的黏合，最終影響打印的精確度。  對于那些完成3D打印后需經(jīng)燒結(jié)處理的支架來說，因為黏結(jié)劑受燃燒影響受損會導(dǎo)致最終成品的強度降低。因此想保證足夠的的機械穩(wěn)定性和強度，就必須降低黏結(jié)劑的集中程度。  

2.2.3  用于3D打印構(gòu)造骨組織工程支架的材料
骨組織工程支架構(gòu)建的材料根據(jù)其性能主要包括人工合成多聚體類、天然高分子聚合物、生物陶瓷及它們的混合物。目前應(yīng)用最多且最有應(yīng)用潛力的為生物陶瓷材料，以下作重點介紹。

人工合成多聚體：這類材料以聚乳酸(PLA)，聚羥基 乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)為代表。這類聚合物屬熱塑性材料，可加工成各種結(jié)構(gòu)形狀，并且可以通過調(diào)增分子量、選擇不同聚合方式及成型手段調(diào)節(jié)并控制材料的力學(xué)性能和降解速度。因其降解產(chǎn)物無毒及良好的生物相容性，PLA和PGA已經(jīng)通過美國FDA的批準(zhǔn)，許可 作為植入物。  

Vacanti等首先將PGA、PLA用作軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)基質(zhì)材料，通過組織工程方法獲得新生軟骨成功。Sherwood等通過3D打印技術(shù)，制備了上層組分為PLGA/PLLA，下層為PLGA/TCP的軟骨-骨復(fù)合支架。研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞更傾向于黏附于支架的軟骨支架區(qū)，培養(yǎng)6周后可以看到軟骨組織的形成。支架的成骨區(qū)力學(xué)強度可以達(dá)到與人新生松質(zhì)骨同一數(shù)量級。該研究為完全關(guān)節(jié)重建技術(shù)提供了一種新的方案。  

Tay等用3D打印技術(shù)將聚己內(nèi)酯和聚乙烯醇的混合粉末制成準(zhǔn)支架，然后再用微粒過濾法將聚乙烯醇除去得到多孔的支架。過濾后的支架疏松柔軟，孔的結(jié)構(gòu)具有高的連通性。  但是人工合成多聚體一般水溶性差，所以溶解其需用到有機溶劑(如氯仿)。氯仿是一種有毒的溶劑，殘留在體內(nèi)會產(chǎn)生毒害作用。雖然利用氯仿提取技術(shù)可以減少氯仿，但是仍存在氯仿殘留在支架內(nèi)的風(fēng)險。另外有機溶劑的使用明顯增加了成本和生產(chǎn)難度，為大規(guī)模批量生產(chǎn)醫(yī)用級支架材料制造了難題。  

天然高分子聚合物：天然高分子聚合物包括膠原、 纖維蛋白、甲殼素及其衍生物和藻酸鹽等，這些天然聚合物生物相容性好，具有細(xì)胞識別信號(如某些氨基酸序列)，利于細(xì)胞黏附、增殖和分化。天然高分子聚合物一般水溶性較好，可以與無需溶劑溶解的黏結(jié)劑結(jié)合。所以大量的天然高分子聚合物用于醫(yī)學(xué)支架材料的打印。但它們存在一些缺點，如難以大量獲取、降解時難以控制等，故很難單獨作為組織工程中成骨性細(xì)胞種植的載體。但其最大的缺點是缺乏一定的機械強度，難以單獨用作成骨細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)材料，可作為良好的材料包埋和添加劑。  

生物陶瓷：以磷酸三鈣(tricalciumphosphate，TCP) 和羥基磷灰石(hydroxylapatite，HA)為代表的磷酸鈣鹽陶瓷是廣泛應(yīng)用的骨替代材料之一，它們都具有優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性能，可不同程度地整合入宿主骨。磷酸三鈣在人的骨骼中普遍存在，是一種良好的骨修復(fù)材料。  磷酸三鈣植入人體后，能在體內(nèi)降解為新骨的形成，提供較豐富的Ca和P[25]，由于此特性，以磷酸三鈣為基料的人工骨材料的研究與應(yīng)用也是當(dāng)今骨組織工程支架發(fā)展的活躍領(lǐng)域。但是，單純的支架的打印似乎已經(jīng)無法滿足對最后成骨效果的期待。

近年來，支架載藥已成為研究熱點，通過添加藥物的方式來調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。袁景等利用3D打印的方法，以β-磷酸三鈣粉末為原料，以磷酸二氫鉀為黏結(jié)劑，制備載藥(地塞米松、β-磷酸甘油酸鈉、維生素C)骨組織工程支架，并與未載藥支架作對比，結(jié)果顯示載藥β-三磷酸三鈣支架在15周內(nèi)基本降解完全，與松質(zhì)骨缺損修復(fù)時間相當(dāng)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附于載藥β-三磷酸三鈣支架表面，并深入支架內(nèi)部，生長良好，增值活躍，細(xì)胞堿性磷酸酶活性有提高，說明載藥β-三磷酸三鈣支架具有良好的細(xì)胞相容性。另外，將兩種生物陶瓷材料混合也呈現(xiàn)比較好的效果。Zhou等 將磷酸鈣(CaP)與硫酸鈣(CaSO4)混合粉末做為原 料，利用3D打印組織工程支架。結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸鈣與硫酸鈣比率越高，則支架的強度越大。

羥基磷灰石也是廣泛應(yīng)用于骨組織工程支架的材料。Fierz等以羥基磷灰石和水溶性黏結(jié)劑為材料，采用3D打印技術(shù)制備了3種類型的圓柱狀中空骨支架，支架直徑3.9-4.2 mm，中心管直徑0.70-0.87 mm，所有支架微孔含量達(dá)70%，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)成骨刺激祖細(xì)胞可較好地附著于支架。羥基磷灰石一大優(yōu)勢是對骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有較強的親和性，Jun等在羥基磷灰石骨組織工程支架中加入含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的涂層，并與不含骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的羥基磷灰石支架作對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的成骨細(xì)胞更加活躍，且骨組織生長情況更好，更加適合作為骨移植替代物的選擇。而羥基磷灰石的弱點在于脆性較大，而純羥基磷灰石不易被吸收，這限制了其應(yīng)用。  

在生物陶瓷粉末的3D打印中，常用酸來做黏結(jié)劑如磷酸和檸檬酸。少量未反應(yīng)的酸黏結(jié)劑殘留一般來講不會產(chǎn)生很大的影響。一些酸如檸檬酸、磷酸和草酸也存在于正常人體內(nèi)，也很容易除去 。剛打印成 型的支架很脆，性質(zhì)不穩(wěn)定，為使其更加兼顧穩(wěn)定，則需在打印完成后將其浸泡在磷酸中使其硬化，或者采用燒結(jié)的方法使鈣磷石熱分解而逐漸形成焦磷酸 鹽，硬度增加。  人工合成多聚體材料因其降解產(chǎn)物無毒及良好的生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于骨組織支架，但是由于其水溶性差而需有機溶劑的引入，使支架內(nèi)殘留毒性物質(zhì)的風(fēng)險增加，限制了其發(fā)展。天然高分子聚合物則水溶性良好，無需有機溶劑的使用，而缺乏機械強度是其最大的缺點，但可作為良好的材料包埋和添加劑。  生物陶瓷既有良好的生物相容性，同時又兼具足夠的機械強度，已成為應(yīng)用最廣泛的骨組織工程支架材料之一，而幾年來支架載藥的研究又為其提供了新的發(fā)展方向。  

3  討論
3D打印技術(shù)應(yīng)用于骨組織工程支架已取得了可喜的成果，并且蘊含著不可估量的前景。但是目前來講，3D打印應(yīng)用于骨組織工程支架并不是完美的，仍需認(rèn)識到其存在的問題與不足。 3D打印的費用比較昂貴，不僅打印設(shè)備及運行費用較高，其材料從前期粉末的制成到后期的燒結(jié)過程中的 花費也不容忽視，打印1個頭顱模型的花費高達(dá) 1 000-2 000美元，這種花費對于中國國情來說并不現(xiàn)實，也限制了其在國內(nèi)的發(fā)展；實現(xiàn)個性化定制雖是3D打印的一項優(yōu)勢，但是，從另一角度講不利于大規(guī)模批量的商業(yè)生產(chǎn)；由于3D打印最初用于工程學(xué)而并非醫(yī)學(xué)，應(yīng)用于支架的構(gòu)建時是一個跨學(xué)科的過程，涉及兩個領(lǐng)域的專業(yè)知識，而目前醫(yī)學(xué)研究人員與工程學(xué)研究人員的研究領(lǐng)域和知識構(gòu)架相對獨立，缺乏專門的技術(shù)人才，這也是今后3D打印更廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)所必須解決和改善的問題；另外，在不同粉末材料的選擇上并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，在分析各材料的優(yōu)劣性時仍無系統(tǒng)可靠的指標(biāo)或缺乏充足的實驗證據(jù)，仍需進(jìn)一步研究從結(jié)構(gòu)、功能、臨床效果等多方面來綜合評價其材料的優(yōu)點與缺點；3D打印后的支架需保持一定的生物相容性，如何增加材料的生物相容性及更接近體內(nèi)微環(huán)境的模擬仍需進(jìn)一步探索；細(xì)胞在3D支架材料內(nèi)部的粘附、生長、分化與細(xì)胞與環(huán)境的作用機制仍需大量研究來闡明。  

未來3D打印技術(shù)應(yīng)用于骨組織工程支架的發(fā)展方向主要包括以下3個方面：
①結(jié)構(gòu)設(shè)計和制造：制備與正常骨組織具有相似的物理、化學(xué)和生物學(xué)功能，具有一定生物相容性兼具一定的生物強度。
②多種細(xì)胞和生長因子的交互作用：考慮各種細(xì)胞以及生長因子的作用，可適當(dāng)擴大打印的單位，直接打印出帶有血管的骨支架。
③生物支架的保存和活性維持：需要充分考慮如何最大程度維持離體骨支架的細(xì)胞活性。

挑戰(zhàn)與希望并存，文章看到3D打印技術(shù)在骨組織工程支架中的應(yīng)用具有巨大的前景，只有同時接受存在的挑戰(zhàn)并逐漸克服，才能發(fā)揮其最大的價值，為未來治療骨缺損提供效率高療效好的治療方法。隨著3D打印技術(shù)的不斷發(fā)展、人們對骨組織工程支架材料的研究、工程學(xué)與醫(yī)學(xué)的不斷交融和相互促進(jìn)，在不久的將來3D打印一定會在骨組織工程支架的構(gòu)造領(lǐng)域中大放異彩。

編輯：南極熊
作者：于  強，田  京