植物細(xì)胞3D打印優(yōu)化：兼顧分辨率與細(xì)胞活性的策略探索

來(lái)源：iBiofabrication

細(xì)胞打印技術(shù)為植物組織工程的發(fā)展提供了技術(shù)支撐，在植物細(xì)胞微環(huán)境研究、高價(jià)值代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、植物基食品制造以及定制化木材合成等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。然而，與已經(jīng)相對(duì)成熟的哺乳動(dòng)物細(xì)胞打印相比，植物細(xì)胞打印尚處于起步階段，仍面臨如細(xì)胞尺寸不均和剪切力敏感等挑戰(zhàn)，難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)高打印分辨率與高細(xì)胞活性。

近期，清華大學(xué)機(jī)械系歐陽(yáng)禮亮團(tuán)隊(duì)以胡蘿卜細(xì)胞為研究對(duì)象，系統(tǒng)探討了植物細(xì)胞團(tuán)形態(tài)對(duì)生物墨水性能的影響，并提出“植物細(xì)胞團(tuán)尺寸與針頭內(nèi)徑匹配”的策略，旨在為植物細(xì)胞的工程化應(yīng)用提供參數(shù)優(yōu)化方案（圖1）。

圖1. 基于胡蘿卜細(xì)胞的植物細(xì)胞3D打印優(yōu)化策略

工作亮點(diǎn)

• 首次建立適用于擠出打印的植物細(xì)胞團(tuán)-針頭尺寸匹配準(zhǔn)則
• 厘米級(jí)大尺寸載植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的打印與穩(wěn)定培養(yǎng)
• 擠出式打印對(duì)植物細(xì)胞功能影響的初步解析
  

研究?jī)?nèi)容
基于懸浮培養(yǎng)獲得的細(xì)胞團(tuán)（S-Cell）的墨水活性與均勻性更好。本研究首先從胡蘿卜外植體培養(yǎng)獲得常規(guī)愈傷組織（R-Callus），隨后通過(guò)物理破碎獲得離散化愈傷組織（F-Callus），并采用懸浮培養(yǎng)獲得細(xì)胞團(tuán)（S-Cell）。其中S-Cell的尺寸最小（174±79 μm），活死染色結(jié)果表明，三種細(xì)胞形態(tài)的初始存活率均較高（R-Callus ~93%，F(xiàn)-Callus ~85%，S-Cell ~97%），因在制備過(guò)程中受機(jī)械剪切作用，F(xiàn)-Callus的存活率相對(duì)較低（圖2）。

圖2. 不同形態(tài)的胡蘿卜細(xì)胞制備與表征

將三種細(xì)胞形態(tài)分別與明膠/海藻酸水凝膠混合制備生物墨水。透明度測(cè)試顯示，S-Cell墨水均勻性最佳。流變學(xué)測(cè)試表明，所有墨水均表現(xiàn)出剪切稀化特性，且墨水均保持溶膠-凝膠溫敏轉(zhuǎn)變能力。這對(duì)形成擠出微絲單元和打印過(guò)程中的結(jié)構(gòu)自支撐至關(guān)重要。在擠出測(cè)試中，S-Cell因其均勻性良好和尺寸小的優(yōu)勢(shì)，可用內(nèi)徑更小的針頭（24G：310μm）進(jìn)行擠出（圖3）。

圖3. 生物墨水的制備與理化性質(zhì)表征

在此基礎(chǔ)上，作者通過(guò)進(jìn)一步測(cè)試不同規(guī)格針頭（18G-24G）的打印效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)針頭直徑能覆蓋85%（臨界分?jǐn)?shù)）以上的細(xì)胞團(tuán)時(shí)，生物墨水可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定打印（圖4）。并且僅S-Cell墨水可順利通過(guò)24G針頭實(shí)現(xiàn)更高分辨率打�。▓D4）和更高細(xì)胞活性（圖5）。

圖4. 生物墨水的打印性能與針頭適配性研究

圖5. 優(yōu)化工藝提高細(xì)胞存活率

作者通過(guò)活死染色定量分析發(fā)現(xiàn)，在打印后，三種墨水細(xì)胞存活率相近，但培養(yǎng)4天后，S-Cell組的細(xì)胞活性提高至80%以上，且35天內(nèi)持續(xù)增殖，載細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持良好形貌和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖5、6）。

圖6. 批量化植物細(xì)胞打印及其長(zhǎng)期培養(yǎng)

團(tuán)隊(duì)使用S-Cell墨水成功打印出厘米級(jí)的“胡蘿卜形狀”結(jié)構(gòu)�；钏廊旧�結(jié)果顯示，不同區(qū)域細(xì)胞活性一致，表明3D打印構(gòu)建的多孔結(jié)構(gòu)有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均勻交換（圖7）。

圖7. 厘米級(jí)胡蘿卜狀結(jié)構(gòu)的生物打印

RNA-seq 分析顯示，打印過(guò)程激活了細(xì)胞壁修復(fù)、防御響應(yīng)、氧化應(yīng)激等基因表達(dá)，提示植物細(xì)胞能通過(guò)自我調(diào)節(jié)應(yīng)對(duì)適度的剪切應(yīng)激（圖8）。但若剪切力過(guò)強(qiáng)，細(xì)胞死亡風(fēng)險(xiǎn)加大。

圖8. 細(xì)胞對(duì)生物打印過(guò)程的應(yīng)激響應(yīng)

總結(jié)與展望
為避免植物細(xì)胞在打印過(guò)程中，因過(guò)高的剪切作用而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和生長(zhǎng)緩慢，本研究首次提出“臨界分?jǐn)?shù)”作為細(xì)胞團(tuán)-噴嘴匹配的重要準(zhǔn)則，為高分辨率與高活性植物細(xì)胞打印提供理論依據(jù)與實(shí)用指導(dǎo)，并通過(guò)RNA-seq分析，初步驗(yàn)證了在合適的剪切作用下，植物細(xì)胞可通過(guò)自調(diào)節(jié)，恢復(fù)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)�？偨Y(jié)而言，打印參數(shù)窗口的選擇對(duì)植物細(xì)胞打印至關(guān)重要。

論文于2025年2月5日發(fā)表于《Biofabrication》，清華大學(xué)機(jī)械系博士生周德志為第一作者，本科生李佩錫為共同第一作者，歐陽(yáng)禮亮副教授為通訊作者，其他合作者包括博士生余爽、前科研助理崔鎮(zhèn)華以及深圳清華大學(xué)研究院徐弢教授。項(xiàng)目獲得國(guó)家自然科學(xué)基金的支持。

原文鏈接：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/adada1