3D打印骨修復研究：分級組裝支架中實現(xiàn)羥基磷灰石的可控釋放

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在骨修復領域，當前面臨著重大挑戰(zhàn)。骨具有復雜的層次結構和多孔網(wǎng)絡，其再生過程呈現(xiàn)出時間和空間的復雜性，涉及多個階段及同步的生物過程。然而，大多數(shù)骨修復材料僅注重空間結構設計，忽略了骨發(fā)育過程中的時間復雜性，無法有效響應甚至阻礙骨愈合，導致骨再生質量不佳。同時，羥基磷灰石（HAp）在骨再生中雖至關重要，但其結構和空間分布的調控一直是難題，不同結晶度和形態(tài)的 HAp 對骨愈合影響各異 。

為解決這些痛點，來自四川大學的樊渝江、孫勇教授團隊開展了相關研究。他們結合 3D 打印技術與超臨界 CO₂ foaming 技術，通過有機 - 無機整合和表面成核生長的方式，將結構化的 HAp 集成到分級組裝支架中。利用可控沉積和分級組裝技術，調控微納結構化 HAp 的空間分布和釋放時間，使其與骨愈合過程相匹配。相關工作以 “Spatially programmed hydroxyapatite in hierarchically assembled scaffold self - adapts osteogenic progression” 為題發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上，為骨修復材料的設計提供了新方向，有望實現(xiàn)高質量的骨再生。

研究內容
1. 裝飾有空間編程羥基磷灰石的分級組裝支架自適應成骨進程
通過構建分級組裝支架并調控其中球形 HAp（sHAp）和納米花狀 HAp（fHAp）空間分布與釋放時間的研究方法，研究了支架對免疫微環(huán)境的改善作用、為骨基質成熟提供鈣 / 磷來源的能力以及與整個骨再生周期的匹配情況。結果表明，調控 sHAp/fHAp 的空間分布和釋放時間，能有效改善免疫微環(huán)境，提供滿足骨基質成熟所需的鈣 / 磷，使支架自適應骨再生的各個階段，實現(xiàn)從促進早期免疫調節(jié)到為骨組織生長持續(xù)提供營養(yǎng)物質的功能，最終達成與骨再生周期的良好匹配，促進高質量骨再生。

圖 1. 裝飾有空間編程羥基磷灰石的分級組裝支架自適應成骨進程示意圖

2. 納米花狀 fHAp 的制備與表征
通過在 PLGA 或 HC 薄膜表面利用模擬體液（SBF）溶液進行可控沉積的方法制備納米花狀 fHAp，運用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）觀察其微觀形貌，使用 X 射線衍射（XRD）分析相組成和結晶度，采用接觸角測量儀測定表面親水性，利用 TG/DSC 測試樣品的相轉變溫度和無機成分含量，借助 X 射線光電子能譜（XPS）檢測 HC 水凝膠中螯合的鈣離子，用鈣比色測定試劑盒量化鈣離子釋放。研究了 fHAp 的微觀結構、結晶度、親水性、鈣離子釋放等特性。結果表明，fHAp 呈花狀，有 50 - 300nm 的多孔結構，結晶度為 31.24%（相對于 sHAp），親水性較好，且能更快釋放鈣離子。

圖 2. 納米花狀 fHAp 的制備與表征。

3.納米花狀 fHAp 調節(jié)巨噬細胞 M2 極化
將炎癥刺激的巨噬細胞與負載 fHAp 和 sHAp 的薄膜共培養(yǎng)，運用 SEM 觀察細胞形態(tài)，通過細胞骨架染色輔助分析，利用流式細胞術檢測巨噬細胞表型，采用 ELISA 試劑盒測定炎癥相關蛋白和因子的表達。研究 fHAp 對巨噬細胞極化行為的影響。結果顯示，fHAp 組巨噬細胞呈典型 M2 形態(tài)，M2 巨噬細胞數(shù)量顯著增加，M1 巨噬細胞數(shù)量減少，同時抗炎因子 TGF-β1 和 IL-10 表達升高，促炎因子 TNF-α 和 IL-1β 表達降低，證明 fHAp 可促進巨噬細胞向 M2 極化。

圖 3. 納米花狀 fHAp 調節(jié)巨噬細胞 M2 極化。

4. 納米花狀 fHAp 的生物學功能
通過水接觸角測試、激光共聚焦顯微鏡觀察、Transwell 實驗、細胞增殖實驗、透射電鏡觀察和免疫熒光染色等方法，研究 fHAp 在蛋白質吸附、干細胞遷移與招募、細胞增殖與鋪展以及膠原礦化方面的能力。結果表明，負載 fHAp 的薄膜接觸角更小，蛋白質吸附更均勻且強度更高，能更好地促進干細胞遷移和招募，對細胞增殖和鋪展的促進作用也更明顯，同時可有效促進膠原纖維礦化，使礦化后的膠原纖維在 TEM 下對比度更高，免疫熒光染色也證實了這一點。

圖 4. 納米花狀 fHAp 的生物學功能。

5. 分級組裝支架的構建及免疫調節(jié)作用
以 3DP PLGA/sHAp 支架為基礎，負載纖維凝膠螯合的 sHAp 并在表面整合 fHAp 構建分級組裝支架，運用 COMSOL Multiphysics 軟件進行離子擴散模擬，使用 SEM 和激光共聚焦顯微鏡觀察 HAp 分布，通過細胞與支架共培養(yǎng)實驗、免疫熒光染色和流式細胞術檢測細胞行為和巨噬細胞極化情況，采用 ELISA 測定炎癥因子表達。研究支架的構建、HAp 的空間分布與釋放行為以及免疫調節(jié)功能。結果顯示，支架中不同位置的 HAp 擴散速率不同，且 MHCP 支架能促進細胞黏附、增殖和鋪展，誘導巨噬細胞向 M2 極化，降低促炎因子表達，增加抗炎因子表達，具有良好的免疫調節(jié)能力。

圖 5. 分級組裝支架的構建及免疫調節(jié)作用。

6.成骨分化和膠原礦化
將骨髓間充質干細胞（BMSCs）接種在分級組裝支架上培養(yǎng)，采用堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅（ARS）染色觀察細胞成骨分化和礦化結節(jié)形成情況，通過實時定量逆轉錄 PCR（qRT-PCR）分析成骨和血管生成相關基因的表達，利用 Micro-CT 分析裸鼠皮下異位成骨情況，結合組織學染色和免疫組化染色觀察新骨形成和膠原纖維礦化。研究分級組裝支架對 BMSCs 成骨分化和膠原礦化的影響。結果表明，MHCP 組的 ALP 和 ARS 染色更明顯，相關基因表達上調，裸鼠皮下新骨形成更多，膠原纖維礦化更顯著，證明該支架能有效促進成骨分化和膠原礦化。

圖 6. 成骨分化和膠原礦化。

7.分級組裝支架修復臨界尺寸顱骨缺損
構建兔顱骨缺損模型并植入不同支架，通過推出試驗評估支架與周圍骨組織的整合能力，利用 Micro-CT 和 X 射線成像系統(tǒng)分析新骨形成情況，采用 RNA 測序研究分子機制，結合免疫熒光染色觀察相關蛋白表達。研究分級組裝支架修復顱骨缺損的效果及機制。結果顯示，MHCP 支架的推出力更高，新骨體積分數(shù)更大，能更好地促進骨再生，其通過調節(jié)免疫反應、促進細胞黏附和陽離子運輸?shù)葯C制實現(xiàn)高效骨修復。

圖 7. 分級組裝支架修復臨界尺寸顱骨缺損。

8.分級組裝支架自適應骨再生過程
對植入分級組裝支架的兔顱骨缺損在不同時間點取材，通過組織學染色（H&E、Masson、ARS）和免疫熒光染色（CD44、Runx2、CD31、OPN 等）觀察骨再生各階段的細胞行為、組織變化和分子調控。研究分級組裝支架在骨再生不同階段的作用。結果表明，在骨再生早期，fHAp 促進巨噬細胞極化和干細胞招募；中期，支架引導組織長入和早期成骨、血管生成；后期，支架完成使命，骨基質重塑為致密新骨組織，實現(xiàn)了高質量的骨再生。

圖 8. 分級組裝支架自適應骨再生過程。

研究結論
本研究結合3D打印技術與超臨界CO₂發(fā)泡技術，通過有機-無機整合和表面成核生長的方式，構建了具有全再生周期調節(jié)能力的時空分級組裝支架。該支架將納米花狀fHAp作為骨愈合早期微環(huán)境的調節(jié)開關，結合支架中結構化HAp的時空釋放，增強了骨重塑過程，最終實現(xiàn)了臨界尺寸骨缺損的再生。這一成果為可降解骨修復材料的結構和功能設計提供了新的研究思路，有望推動骨修復領域的發(fā)展，為臨床治療骨缺損相關疾病提供更有效的解決方案。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162437