解鎖體積生物打印潛能！低強(qiáng)度脈沖超聲賦能 3D 打印支架

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

尿道狹窄是泌尿外科常見(jiàn)難題，手術(shù)治療常需器官或組織移植，但面臨供體不足和排異風(fēng)險(xiǎn)。組織工程研究致力于體外培養(yǎng)組織以解決這一問(wèn)題，其中生物材料和制造方法是關(guān)鍵。明膠甲基丙烯酰（GelMA）因良好的生物相容性等優(yōu)勢(shì)在組織工程中備受關(guān)注，而體積生物打�。╒BP）能快速制造厘米級(jí)構(gòu)建體且維持高細(xì)胞活力。人尿源性干細(xì)胞（hUSCs）具有多種優(yōu)勢(shì)，是尿道組織工程的理想種子細(xì)胞。然而，使用 GelMA - 3D 打印構(gòu)建宏觀尿道組織面臨諸多挑戰(zhàn)，如維持細(xì)胞活力和功能、整合多種細(xì)胞類型等。此外，從二維培養(yǎng)到三維環(huán)境，確保細(xì)胞長(zhǎng)期活力和功能是一大難題。低強(qiáng)度脈沖超聲（LIPUS）雖被認(rèn)為可促進(jìn)細(xì)胞增殖，但它對(duì) 3D 支架中 hUSCs 的影響尚不明確。

來(lái)自廣州醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院的賴德輝教授、卞軍教授團(tuán)隊(duì)合作利用 VBP 技術(shù)將 hUSCs 整合到 GelMA 支架中，研究不同參數(shù)的 LIPUS 對(duì) hUSCs 活力的影響，并探索其分子機(jī)制。相關(guān)工作以 “Low - intensity pulsed ultrasound promotes cell viability of hUSCs in volumetric bioprinting scaffolds via PI3K/Akt and ERK1/2 pathways” 為題發(fā)表在《Biomedical Materials》上。

研究?jī)?nèi)容
1. hUSCs的分離鑒定與多向分化能力驗(yàn)證
通過(guò)對(duì)健康男性尿液樣本進(jìn)行離心、培養(yǎng)等處理獲取hUSCs，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表面抗原進(jìn)行鑒定，并使用特定誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成骨、成脂分化誘導(dǎo)，再通過(guò)茜素紅和油紅O染色來(lái)評(píng)估分化情況。結(jié)果顯示，hUSCs呈現(xiàn)梭形形態(tài)，高表達(dá)CD44、CD73和CD90等干細(xì)胞相關(guān)抗原，且能成功分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，具備多向分化潛能。

圖1. 負(fù)載人尿源性干細(xì)胞（hUSCs）的 GelMA 水凝膠支架的 3D 生物打印流程圖

圖2. 人尿源性干細(xì)胞（hUSCs）的分離和表面抗原表型分析

圖3. 人尿源性干細(xì)胞（hUSCs）的分化潛能

2. GelMA生物支架的制備與特性研究
將GelMA粉末溶解在PBS中，添加交聯(lián)劑和hUSCs制備生物墨水，利用3D打印技術(shù)構(gòu)建支架，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察其微觀結(jié)構(gòu)，通過(guò)壓縮測(cè)試獲取應(yīng)力 - 應(yīng)變曲線以分析機(jī)械性能，進(jìn)行體外降解實(shí)驗(yàn)探究降解特性。結(jié)果表明，GelMA生物支架具有可打印性，呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，孔徑在80μm左右，其楊氏模量與濃度呈正相關(guān)，在PBS緩沖液中約21天可完全降解，展現(xiàn)出良好的生物相容性和可降解性。

圖4. GelMA生物支架的制備和表征

3. LIPUS對(duì)2D環(huán)境中hUSCs增殖的影響
設(shè)置不同的LIPUS強(qiáng)度，對(duì)培養(yǎng)在平板上的hUSCs進(jìn)行刺激，運(yùn)用CCK - 8檢測(cè)和活/死染色技術(shù)，在不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估細(xì)胞增殖情況。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，LIPUS能促進(jìn)hUSCs增殖，其中100 mW/cm^2 強(qiáng)度且連續(xù)兩次10分鐘處理的效果最佳，該條件下hUSCs的細(xì)胞密度和增殖活性顯著高于對(duì)照組。

圖5. 不同強(qiáng)度LIPUS對(duì)2D培養(yǎng)hUSCs增殖的影響  

4. GelMA濃度對(duì)hUSCs在3D支架中生長(zhǎng)的影響
制備不同濃度（2.5%、5%、7.5%、10%）的GelMA生物支架，將hUSCs接種其中，通過(guò)活/死染色在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，2.5% GelMA濃度的支架最有利于hUSCs的黏附和生長(zhǎng)，隨著GelMA濃度增加，hUSC的黏附數(shù)量明顯減少，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差。

圖6. GelMA濃度對(duì)體積生物打印載細(xì)胞GelMA支架中hUSCs增殖的影響

5. LIPUS對(duì)3D環(huán)境中hUSCs增殖的影響及機(jī)制探究
在3D GelMA支架培養(yǎng)體系下，改變LIPUS強(qiáng)度，利用CCK - 8檢測(cè)、活/死染色、流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot分析等方法，檢測(cè)hUSCs的增殖、細(xì)胞周期分布以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，150 mW/cm^2 的LIPUS對(duì)3D支架中hUSCs的增殖刺激效果最佳；LIPUS可促使hUSCs從G0/G1期進(jìn)入S和G2/M期，增加細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，同時(shí)激活ERK1/2和PI3K - Akt信號(hào)通路，而抑制這兩條通路會(huì)減弱LIPUS誘導(dǎo)的hUSC增殖作用。

圖7. LIPUS對(duì)3D GelMA支架中hUSCs增殖的影響

圖8. 不同LIPUS強(qiáng)度對(duì)3D GelMA支架中hUSCs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

圖9. 體積生物打印載細(xì)胞GelMA支架中hUSCs的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）和PI3K - Akt的磷酸化

研究結(jié)論
本研究表明，低強(qiáng)度脈沖超聲（LIPUS）可促進(jìn) 3D GelMA 支架中人尿源性干細(xì)胞（hUSCs）的增殖，這可能是通過(guò)激活 ERK1/2 和 PI3K-Akt 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為在 3D 培養(yǎng)環(huán)境中利用 LIPUS 促進(jìn) hUSCs 增殖提供了支持。研究確定了適用于 hUSCs 的 LIPUS 最佳參數(shù)，即頻率 1.5MHz、空間平均時(shí)間平均強(qiáng)度（ISATA）為 150 mW/cm^2、每次照射 10 分鐘，連續(xù)照射兩次 。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2.5% 濃度的 GelMA 支架最有利于 hUSCs 的生長(zhǎng)和增殖。這些結(jié)果為尿道組織工程中應(yīng)用 LIPUS 和 GelMA 支架提供了理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

挑戰(zhàn)與展望
在材料方面，GelMA 支架需進(jìn)一步優(yōu)化，以更好地平衡物理可打印性與生物相容性，特別是在處理脆弱干細(xì)胞時(shí)，需在保證細(xì)胞活力的同時(shí)提升打印性能。在 LIPUS 應(yīng)用上，雖然確定了促進(jìn) hUSCs 增殖的最佳參數(shù)，但不同細(xì)胞類型對(duì) LIPUS 的反應(yīng)存在差異，其作用機(jī)制尚未完全明確，仍需深入研究。未來(lái)，有望開(kāi)發(fā)出更理想的生物材料，與 LIPUS 更有效地結(jié)合，構(gòu)建出更接近人體生理環(huán)境的組織模型，推動(dòng)組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為尿道狹窄等疾病的治療帶來(lái)新的突破。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1088/1748-605X/ad920f