3D打印作為擴(kuò)大T細(xì)胞制造生物混合水凝膠規(guī)模的策略

來源： EngineeringForLife

細(xì)胞免疫治療的出現(xiàn)為對(duì)抗癌癥、自身免疫疾病和傳染病帶來了更高效的策略。然而，這些治療相關(guān)的細(xì)胞制造過程仍然昂貴且耗時(shí)，限制了它們的應(yīng)用范圍。最近，受淋巴結(jié)啟發(fā)的PEG-肝素水凝膠被證明能夠改善實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下的原始人類T細(xì)胞培養(yǎng)。

為了進(jìn)一步推動(dòng)其臨床應(yīng)用，來自西班牙巴塞羅那自治大學(xué)(UAB)材料研究所(ICMAB-CSIC)的Judith Guasch等團(tuán)隊(duì)評(píng)估了其可擴(kuò)展性，并通過3D打印成功實(shí)現(xiàn)。因此，我們能夠提高原始人類T細(xì)胞在生物混合PEG-肝素水凝膠中的浸潤能力，同時(shí)增加營養(yǎng)、廢物和氣體的傳輸，從而在保持表型的同時(shí)提高了原始人類T細(xì)胞的增殖率。因此，本文向滿足改進(jìn)細(xì)胞免疫療法中所用細(xì)胞產(chǎn)品制造的要求邁出了一步。相關(guān)工作以題為“3D Printing as a Strategy to Scale-Up Biohybrid Hydrogels for T Cell Manufacture”的文章發(fā)表在2024年09月16日的期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。

1.創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
3D打印允許通過逐層方法自動(dòng)化制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)的3D物體，這些結(jié)構(gòu)具有精確設(shè)計(jì)的幾何形狀。在不同類型的3D打印技術(shù)中，擠出基打印在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其流行，因?yàn)樗��?jiǎn)單地包括通過噴嘴擠出材料并將其以絲狀形式沉積在平臺(tái)上，以形成3D結(jié)構(gòu)。為了在制造人工淋巴結(jié)方面向前邁出一步，并幫助克服當(dāng)前與大量治療性T細(xì)胞制造相關(guān)的ACT限制，之前描述的PEG-肝素水凝膠被分析作為3D打印的墨水，并用于人類T細(xì)胞培養(yǎng)（圖1）。

圖1 使用3D打印水凝膠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的自體T細(xì)胞產(chǎn)品制造簡(jiǎn)化方案

【PEG-肝素水凝膠作為3D打印的墨水】

為了優(yōu)化營養(yǎng)、氣體和廢物交換，以最大化細(xì)胞存活率和增殖，選擇了3D支架設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)保持了水凝膠固有的微米級(jí)孔隙度，其有效性之前已得到證明。此外，選擇了一種簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，這種設(shè)計(jì)常用于評(píng)估新材料，由四層網(wǎng)格組成，線條間距為1.5毫米（圖2A）。其簡(jiǎn)單性也有助于其轉(zhuǎn)化潛力和技術(shù)轉(zhuǎn)移選項(xiàng)。為此，PEG-肝素水凝膠被預(yù)先成型并測(cè)試作為3D打印的墨水，在室溫下和不同的水凝膠形成時(shí)間進(jìn)行。混合兩種組分4小時(shí)后，4臂PEG硫醇和馬來酰亞胺功能化的肝素樣本達(dá)到了足夠的粘度，可以進(jìn)行打�。▓D2B）。然而，所得支架顯示出一致性低，打印網(wǎng)格中的線條分化不良。為了提高其質(zhì)量，預(yù)成型的水凝膠在混合后12小時(shí)使用，得到了適合本文目的的支架（圖2C）。最后，本文還評(píng)估了將PEG-肝素水凝膠溶解在細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行潛在載細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的可能性。在這種情況下，水凝膠的形成立即發(fā)生，可能是由于存在較少的二價(jià)離子，這促進(jìn)了二硫鍵的形成，從而減少了可用于水凝膠形成的硫醇。有趣的是，所得材料可以很容易地打�。▓D2D）。

圖2 為優(yōu)化PEG-肝素水凝膠的3D打印而設(shè)計(jì)的支架示意圖

【PEG-肝素印跡支架用于CD4+ T細(xì)胞擴(kuò)增】
一旦證明了PEG-肝素水凝膠的可打印性，就打印并評(píng)估了3D層狀結(jié)構(gòu)作為初級(jí)人CD4+ T細(xì)胞培養(yǎng)的3D支架。作為起點(diǎn)，使用約35和50微克的材料，分別制造了由4層或6層組成的支架，每條線之間的間隔為1.5毫米。然后，以每毫升106個(gè)細(xì)胞的濃度，將初級(jí)人CD4+ T細(xì)胞接種在它們上面，培養(yǎng)6天。接著，通過流式細(xì)胞術(shù)獲得了樣品和對(duì)照（懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞）的增殖、復(fù)制和擴(kuò)增指數(shù)（32），并進(jìn)行比較（見圖3A–C）。

在下一步中，分析了兩種類型的3D打印水凝膠在接種后5天產(chǎn)生的T細(xì)胞的表型。特別是，細(xì)胞被分類為初始型（TN；CD45RO-/CD62L+）、中心記憶型（TCM；CD45RO+/CD62L+）、效應(yīng)型（TEFF；CD45RO-/CD62L-）和效應(yīng)記憶型（TEM；CD45RO+/CD62L-）。對(duì)于四層水凝膠（圖3D），觀察到TCM表型的百分比顯著增加，同時(shí)TEM減少。具體來說，四層打印水凝膠的TCM中位值為66%，陽性對(duì)照為61%，而陰性對(duì)照為45%。此外，打印支架的TEM平均值為23%，與陽性對(duì)照的30%和陰性對(duì)照的14%相比。最后，TN細(xì)胞從失活細(xì)胞的39%顯著減少到懸浮培養(yǎng)或使用水凝膠培養(yǎng)的細(xì)胞的5%和6%，盡管激活細(xì)胞之間沒有獲得顯著差異。盡管對(duì)于六層支架也觀察到了類似的趨勢(shì)，但觀察到的差異不太明顯，特別是對(duì)TCM表型而言（圖3E）。   

圖3 在打印的PEG-肝素水凝膠中培養(yǎng)6天的初級(jí)人類CD4+ T細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化增殖結(jié)果，水凝膠高度為4層或6層，以及懸浮培養(yǎng)（陽性對(duì)照）

【通過3D打印技術(shù)擴(kuò)大水凝膠的尺寸】

最近的研究已經(jīng)證明，使用PEG-肝素水凝膠可以改善免疫細(xì)胞的培養(yǎng)效果，包括增殖和分化，這對(duì)于如ACT等細(xì)胞療法來說是有趣的結(jié)果。然而，這些治療需要培養(yǎng)體積可能達(dá)到升的量級(jí)，而目前的結(jié)果是在不到1毫升的體積下取得的。因此，有必要擴(kuò)大水凝膠的尺寸以實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用。但是，支架尺寸的增加肯定會(huì)使細(xì)胞、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的傳輸更加困難。為了解決這個(gè)問題，本文研究了使用3D打印技術(shù)來擴(kuò)大支架尺寸的方法。因此，本文選擇了一個(gè)直徑更大的針頭（25G）并比較了其與之前的針頭的可打印性。在這兩種情況下，通過將預(yù)先形成的PEG-肝素水凝膠通過針頭擠出并打印片段，獲得了連續(xù)的纖維（圖4A, B）。如本文所預(yù)期的那樣，使用更大針頭得到的纖維直徑顯著增加（圖4C）。   

圖4 在空氣中擠出的水凝膠和用27G和25G針頭打印的纖維的代表圖像

此外，擴(kuò)散比也從1.68 ± 0.35（27G）增加到2.49 ± 0.41（25G），在兩種情況下都是可以接受的，因?yàn)樗鼈兌荚?到3之間。（33）此外，通過設(shè)計(jì)一個(gè)由十層組成的圓形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，每層之間的線條間隔為1.5毫米，并以交替的方式垂直排列，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修改（圖5A）。這種新設(shè)計(jì)使我們能夠?qū)⒋蛴〔牧系臄?shù)量增加10倍。為了進(jìn)一步表征新設(shè)計(jì)，本文采用X射線微計(jì)算機(jī)斷層掃描成像和環(huán)境掃描電子顯微鏡（SEM）來測(cè)量打印水凝膠的孔徑和互連性（圖5B, C）。正如圖像所示，可以看到分層結(jié)構(gòu)以及之前在大塊水凝膠中觀察到的水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)。   

圖5 為最大化支架尺寸而設(shè)計(jì)的3D打印水凝膠的示意圖和照片圖像，其直徑為1厘米，以及所用材料的數(shù)量

此外，通過流變學(xué)測(cè)量了支架的機(jī)械性能（圖S3），并與未打印材料進(jìn)行了比較。打印水凝膠的儲(chǔ)能模量（G′）為447 ± 34 Pa，而未打印水凝膠的儲(chǔ)能模量為1.1 ± 0.1 kPa。如預(yù)期的那樣，與大塊水凝膠中的相同材料相比，打印水凝膠在打印時(shí)失去了部分硬度。然而，兩種水凝膠類型的機(jī)械性能是可比的，打印的水凝膠提供了更好的細(xì)胞進(jìn)入材料內(nèi)部的可及性，與大塊水凝膠相比，提供了更好的機(jī)會(huì)來擴(kuò)大這種材料的使用規(guī)模。最后，大型3D打印水凝膠被用于培養(yǎng)原代人類CD4+T細(xì)胞（圖6）。為了確定打印結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，本文將結(jié)果與相同質(zhì)量但未打印的水凝膠（大塊結(jié)構(gòu)）進(jìn)行了比較。

圖6 在播種后6天，懸浮培養(yǎng)的初級(jí)人類CD4+ T細(xì)胞（陽性對(duì)照）、大塊非打印PEG-肝素水凝膠（10x N.P）和大塊3D打印PEG-肝素水凝膠（10x 3D P）的標(biāo)準(zhǔn)化增殖結(jié)果

2.總結(jié)與展望

本文證明了PEG-肝素水凝膠可以成功進(jìn)行3D打印，這為包括載細(xì)胞結(jié)構(gòu)在內(nèi)的眾多潛在應(yīng)用打開了大門。此外，與懸浮培養(yǎng)相比，在打印支架中孵育的原始人類CD4+ T細(xì)胞的增殖得到了增強(qiáng)，6層支架的增殖率高于四層支架。另外，這些3D打印的水凝膠在第5天時(shí)增加了TCM細(xì)胞的百分比，這是一種與免疫治療高效性相關(guān)的表型。最后，生產(chǎn)了大型3D打印水凝膠以評(píng)估PEG-肝素實(shí)驗(yàn)室水凝膠的可擴(kuò)展性，因此，它們作為ACT所需的免疫細(xì)胞培養(yǎng)用3D支架的潛在用途。在這些實(shí)驗(yàn)中，與最先進(jìn)的懸浮方法和整體水凝膠相比，3D打印水凝膠獲得了更高的增殖比率。這些結(jié)果可以通過3D打印水凝膠與整體水凝膠相比，細(xì)胞、廢物、營養(yǎng)和氣體向內(nèi)部傳輸?shù)脑鰪?qiáng)來解釋。因此，我們展示了將材料優(yōu)勢(shì)與3D打印技術(shù)優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，可能產(chǎn)生在臨床上有用的PEG-肝素水凝膠。   



文章來源：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.4c06183