3D打印Janus異質微球精準控釋實現(xiàn)全周期調控骨再生

來源： EngineeringForLife

據統(tǒng)計，全球每年骨移植手術量約200萬例，盡管自體骨及同種異體骨移植具有良好的骨再生效果，但由于存在供區(qū)并發(fā)癥及供體來源限制等問題，仍有90%以上的手術需借助骨移植材料完成，因此，目前臨床對骨移植材料具有龐大的需求。由于天然骨組織以磷酸鈣為主體成分，因此現(xiàn)有骨替代品主要以磷酸鈣基材料為主，通過將鈣磷原料直接供給缺損區(qū)，實現(xiàn)骨引導作用。然而，文獻表明，該類磷酸鈣基材料植入體內后，并非直接與受區(qū)融合成骨，而是通過降解再成骨的方式促進骨再生，同時，其降解率較低，長期的空間占位也影響了新骨的有效重建。因此，這種以成熟骨組織的主要化學成分作為骨替代品的主要成分的Top down策略存在成骨效率低、影響新骨的高效再生等缺點。

基于此，浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院謝志堅教授、石玨醫(yī)師團隊與浙江大學機械工程學院賀永教授團隊合作，通過解析骨再生序列事件，研發(fā)設計了通用型Janus異質微球控釋系統(tǒng)，通過精準調控異質微球的釋放行為，靶向骨愈合過程中多個生物學事件，從而實現(xiàn)全周期高效促進骨再生，相關研究“A Janus Microsphere Delivery System Orchestrates Immunomodulation and Osteoinduction by Fine-tuning Release Profiles”以封面文章發(fā)表于《Small》雜志（DOI: 10.1002/smll.202403835），浙大附屬口腔醫(yī)院博士生史洋及碩士生顧靜怡為共同第一作者。

研究人員通過深入剖析骨愈合的多個生物學事件，包括炎癥期、修復期、礦化期等，采用性能高度可調的甲基丙烯�；�明膠實現(xiàn)對臨床常用生物活性分子骨形態(tài)蛋白-2（BMP-2）及磷酸鈣材料（CPO）的精準控釋，以最簡單的“配方”實現(xiàn)對復雜生物學過程的按需調控，該Bottom up（自下而上）再生調控策略（靶向骨再生系列生物學事件設計骨替代品）為臨床骨替代品的革新提供了新思路。   

基于Bottom up再生理念的Janus異質微球控釋系統(tǒng)

1.Janus異質微球控釋系統(tǒng)的設計與制造
研究人員選用性能高度可調的GelMA水凝膠作為Janus異質微球控釋系統(tǒng)的主體成分，通過調控GelMA的取代率，實現(xiàn)對雙重生物活性成分（BMP-2和CPO）的精準控釋。載活性成分的不同取代率GelMA基墨水均具有理想的流變性能（圖1 A、B），為高精度投影式光固化3D打印制造提供了前提條件。在軟件中設計Janus形態(tài)的異質微球后（圖1 C），利用EFL的光固化打印機(EFL-BP86系列生物3D打印機)成功構建了粒徑約為1 mm的Janus異質微球（圖1 D-F），該微球具備理想的可注射性能（圖1 G、H），有助于嚴密填充復雜形態(tài)的骨缺損。   

圖1 Janus異質微球的設計與制造

2.Janus異質微球的理化性能探索
Janus異質微球表面完整，呈微納級多孔狀微結構（圖2 A），含CPO的一側微球能檢測到鈣元素分布（圖2 B），表明投影式光固化3D打印技術能實現(xiàn)微球雙相成分的精準制造。傅里葉紅外結果進一步表明CPO與GelMA之間存在化學結合力（圖2 C），這為精準控釋CPO提供了前提條件。將不同取代率的GelMA水凝膠分別負載BMP-2及CPO，實現(xiàn)了對雙重活性成分的靈活控釋，低取代率GelMA能快速釋放因子，而高取代率GelMA則具有可控的釋放性能（圖2 D、E），同時，其控釋行為也一定程度受到該系統(tǒng)的整體降解及溶脹性能的調控（圖2 F、G）。   

圖2 Janus異質微球的理化性能探索   

3.Janus異質微球實現(xiàn)精準免疫調控
各組Janus異質微球與巨噬細胞RAW264.7共培養(yǎng)后，早期高濃度鈣離子的釋放（Fast組）將驅使巨噬細胞向M1表型極化，而低濃度緩慢釋放CPO（Delayed組和Sequence組）則能促進M2型巨噬細胞分化（圖3 A-F），抑制促炎因子TNF-a，并促進抗炎因子IL-10的分泌（圖3 G）。RNA-seq結果進一步提示，該免疫調控過程可能通過激活JAK-STAT信號通路，優(yōu)化了骨免疫微環(huán)境，加速了血管化及礦化過程（圖3 H-L）。  

圖3 Janus異質微球的免疫調控能力

4.Janus異質微球靶向調控骨再生序列事件   
各組Janus異質微球與骨髓間充質干細胞BMSC共培養(yǎng)后，各組細胞增殖及活性良好（圖4 A、B），負載雙因子的Janus異質微球的成骨活性顯著高于無因子負載的純GelMA組（Control組），特別地，F(xiàn)ast組和Sequence組表現(xiàn)出最為優(yōu)異的成骨潛能（圖4 C-I），這可能與初期相對高濃度釋放BMP-2有關，同時，持續(xù)緩慢的CPO釋放也為晚期礦化過程提供了充足的鈣磷原料。RNA-seq結果進一步提示，Sequence組能上調愈合過程中早期、中期及晚期成骨相關基因（圖4 J），激活骨再生序列事件中的多個生物學行為及信號通路（圖4 K、L），實現(xiàn)對骨修復過程的全周期調控。

圖4 Janus異質微球的成骨性能

5.Janus異質微球通過優(yōu)化體內骨免疫微環(huán)境實現(xiàn)高效骨再生
為進一步評估Janus異質微球的體內免疫調控及促骨再生行為，研究人員首先將各組微球植入至大鼠皮下，術后3、7天后，進行巨噬細胞免疫熒光染色，結果顯示，所有組別中均存在不同程度的巨噬細胞（F4/80+）包裹，與體外結果一致的是，早期低濃度釋放CPO的Delayed組和Sequence組，具有較高比例的F4/80+CD206+細胞，而Fast組中微球周圍則出現(xiàn)大量的F4/80+CD86+細胞，這意味著Janus異質微球的不同控釋行為能精準調控體內免疫微環(huán)境，持續(xù)低濃度鈣離子的釋放有助于創(chuàng)造利于成骨的抗炎微環(huán)境（圖5）。將各組微球植入至大鼠顱骨缺損后，Sequence組實現(xiàn)了最高效的骨愈合，術后8周后在微球間觀察到大量的新生骨，較其他組別更為成熟，且有完整的骨橋連接，這一現(xiàn)象得益于BMP-2在微球控釋系統(tǒng)的高效按需釋放，及CPO的持續(xù)性釋放，既有利于早期免疫調控，也為晚期的骨基質礦化成熟提供了有利條件。

圖5 Janus異質微球的體內免疫調控能力

圖6 Janus異質微球的體內成骨能力的影像學評估

圖7 Janus異質微球的體內成骨能力的組織學評估

綜上，該項工作基于Bottom up骨修復理念，通過采用性能高度可調的GelMA水凝膠，實現(xiàn)對雙重活性成分的靈活控釋，靶向骨再生序列階段，完成高效骨修復。該策略充分挖掘了GelMA水凝膠固有的理化性能，實現(xiàn)對復雜生物學過程的精準調控，過程中無更多化學成分的添加，為通用性綠色載藥控釋平臺的構建提供了新思路，也為臨床轉化提供了優(yōu)良的前提條件。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/smll.202403835