人工智能高通量篩選水凝膠均勻打印條件，加速糖尿病傷口愈合

來(lái)源： EFL生物3D打印與生物制造

糖尿�。―iabetes mellitus, DM）在世界范圍內(nèi)為高發(fā)疾病, 其中我國(guó)患病人數(shù)最高, 在20~79歲人群中患者數(shù)量約1億人。而在糖尿病患者中, 約20%可出現(xiàn)傷口愈合困難。若糖尿病患者傷口遷延不愈可導(dǎo)致糖尿病足或截肢，是造成糖尿病高致殘率的主要并發(fā)癥，嚴(yán)重情況下可威脅患者生命。傷口愈合需要多種因素協(xié)同作用才能使其恢復(fù)屏障功能。造成糖尿病傷口愈合困難的機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、長(zhǎng)期慢性炎癥、新生血管減少、末梢神經(jīng)病變、細(xì)胞外基質(zhì)累積及重塑等。

促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合仍然是臨床治療難點(diǎn)。臨床目前主要的治療措施包括在控制血糖的基礎(chǔ)上預(yù)防傷口感染并促進(jìn)傷口愈合。若出現(xiàn)感染，主要處理措施為清創(chuàng)、敷料、全身使用抗生素等。新研究的生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞等療法，因有效性證據(jù)有限、成本較高等原因?qū)е聭?yīng)用進(jìn)展緩慢。因此研發(fā)理想的傷口敷料仍然是促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合的重要突破口。

為此，來(lái)自中山大學(xué)的周建華教授、黃璐助理教授團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Yu Shrike Zhang（張宇）教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種人工智能輔助的高通量印刷條件篩選系統(tǒng)（artificial intelligence-assisted high-throughput printing-condition-screening system, AI-HTPCSS），該系統(tǒng)以高通量方式篩選獲得均勻的水凝膠結(jié)構(gòu)的印刷條件，通過(guò)優(yōu)化打印條件，打印的支架表現(xiàn)出優(yōu)秀的機(jī)械性能、體外生物學(xué)性能，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明其加速了糖尿病傷口的愈合。相關(guān)工作以題為“Artificial Intelligence-Assisted High-Throughput Screening of Printing Conditions of Hydrogel Architectures for Accelerated Diabetic Wound Healing”于2022年7月10日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》雜志上。

3D 生物打印是運(yùn)用層積制造法，借由3D生物打印機(jī)，制造利用生物墨水，制造出支架、仿生組織、和人類器官等，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和組織模型工程領(lǐng)域有極大應(yīng)用。隨著生物材料墨水類型的快速增長(zhǎng)和不同支架的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的印刷條件可能不再適用。實(shí)際上，最佳打印參數(shù)通常受多種因素影響，包括但不限于3D生物打印系統(tǒng)的品牌、外部環(huán)境以及生物墨水的理化性質(zhì)。因此，開(kāi)發(fā)快速篩選打印條件的有效策略，以促進(jìn)生物打印機(jī)和生物墨水匹配更佳的打印質(zhì)量，是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

為解決該問(wèn)題，本研究提出了一種人工智能輔助的高通量印刷條件篩選系統(tǒng)（AI-HTPCSS）。AI-HTPCSS由可編程氣動(dòng)擠壓生物打印機(jī)和AI輔助圖像分析算法組成。可編程氣動(dòng)擠壓生物打印機(jī)的特點(diǎn)是改進(jìn)的氣體驅(qū)動(dòng)3D生物打印機(jī)和分級(jí)收集基板。與具有水平表面的傳統(tǒng)基板相比，分級(jí)收集基板以0.57°的角度傾斜，這使得打印距離參數(shù)可以通過(guò)簡(jiǎn)單地沿著坡度方向移動(dòng)打印頭來(lái)連續(xù)調(diào)整，提供了更高的精度，減少了延遲時(shí)間。借助可編程氣動(dòng)擠出生物打印機(jī)，可以以高通量的方式協(xié)同調(diào)整三個(gè)主要參數(shù)（打印壓力、噴嘴移動(dòng)速度和打印距離），在參數(shù)不同組合下快速沉積生物油墨。進(jìn)一步通過(guò)AI輔助圖像分析算法對(duì)沉積在基板上的水凝膠圖像進(jìn)行處理并輸出優(yōu)化的參數(shù)，為打印精確匹配相應(yīng)數(shù)字設(shè)計(jì)的均勻水凝膠支架提供指導(dǎo)。（圖1）

圖1 AI-HTPCSS用于加速糖尿病創(chuàng)面愈合的水凝膠結(jié)構(gòu)打印條件

1. AI-HTPCSS的構(gòu)建
AI-HTPCSS 由可編程氣動(dòng)擠壓（生物）打印機(jī)和 AI 輔助圖像分析算法組成。擠壓生物打印機(jī)是改進(jìn)的氣體驅(qū)動(dòng) 3D生物打印機(jī)（圖2A）和分級(jí)收集基板（圖2B），與具有水平表面的傳統(tǒng)構(gòu)建板相比，獨(dú)特的漸變板是以 0.57° 的角度傾斜（圖2C），因此，打印距離參數(shù)（即噴嘴與基板表面之間的距離）可以簡(jiǎn)單地通過(guò)沿著坡度方向移動(dòng)打印頭穿過(guò)梯度板，達(dá)到連續(xù)調(diào)整。由于距離變化變得連續(xù)，因此該配置具有更高的精度，同時(shí)減少了延遲時(shí)間。

優(yōu)化后的打印頭用于氣動(dòng)擠出生物材料墨水并將其沉積在構(gòu)建板上。施加到打印頭的移動(dòng)速度和壓力由 Repetier-Host 軟件編程。借助可編程的氣動(dòng)擠壓生物打印機(jī)，以高通量的方式協(xié)同調(diào)節(jié)三個(gè)主要參數(shù)（打印壓力、噴嘴移動(dòng)速度和打印距離），并在不同的組合下快速沉積生物油墨。

在高通量打印之后，沉積在構(gòu)建板上的水凝膠圖案只需用手機(jī)從頂部拍攝即可。圖像經(jīng)過(guò)人工智能輔助圖像分析算法進(jìn)一步處理（該算法經(jīng)過(guò)預(yù)訓(xùn)練，可自動(dòng)識(shí)別和提取照片中的圖案信息）。最后，輸出優(yōu)化的參數(shù)，為打印與相應(yīng)數(shù)字設(shè)計(jì)精確匹配的水凝膠支架提供指導(dǎo)。

圖2 AI-HTPCSS 的硬件配置

2. 使用 AI-HTPCSS 篩選印刷參數(shù)
在3D生物打印技術(shù)中，零維(0D)的液滴和一維的線條是構(gòu)建復(fù)雜的二維平面或三維體積支架的組成部分。因此，該研究從液滴和線條的圖案開(kāi)始篩選。在三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)（即印刷壓力、噴嘴移動(dòng)速度和印刷距離）的不同組合下，擠出的藻酸鹽-明膠油墨的液滴和線條圖案如圖3A所示。結(jié)果表明，墨滴在長(zhǎng)打印距離處形成，而線條通常在短打印距離處形成。線形在低速（6-8 mm/s）下容易受到打印距離的影響，但在采用10 mm/s的高速時(shí)影響較小。

為了進(jìn)一步分析印刷參數(shù)對(duì)藻酸鹽-明膠油墨擠出圖案的精確影響，本研究開(kāi)發(fā)了一種新型的人工智能輔助圖像分析算法。首先，如圖 3B所示，將包含不同圖案的擠出水凝膠的圖像劃分為94個(gè)子區(qū)域（每個(gè)子區(qū)域50 × 50像素，每個(gè)子區(qū)域 10 mm × 10 mm），以獲得不同圖案的小圖像。然后，使用經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的機(jī)器學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)，準(zhǔn)確識(shí)別每個(gè)子區(qū)域中的模式狀態(tài)。根據(jù)識(shí)別結(jié)果，總結(jié)了模式狀態(tài)的相圖（圖3C）。

通過(guò)逐行掃描方法對(duì)不同條件下打印的線條寬度進(jìn)行量化（圖3D（i））。計(jì)算預(yù)期水凝膠線區(qū)域內(nèi)的像素?cái)?shù)，然后根據(jù)縮放器將其轉(zhuǎn)換為寬度值。通過(guò)這種方式，以高通量的方式獲得了不同打印參數(shù)下的線寬，在圖 3D(ii)中顯示為相圖。此外，繪制了顯示線寬分布的曲線，并通過(guò)計(jì)算變異系數(shù) (CV) 來(lái)確定線的均勻性，如圖3E(i, ii)所示。結(jié)果表明，當(dāng)印刷壓力保持在30-40 psi且噴嘴移動(dòng)速度保持在8-10 mm/s時(shí)，可以獲得高度均勻的線條。最后，如圖 3E(iii)所示，得出了顯示不同打印參數(shù)下線條均勻度程度的相圖。

圖3 使用 AI-HTPCSS 篩選打印參數(shù)

3. 在優(yōu)化條件下打印 3D 水凝膠支架
基于上面篩選出的打印高保真線的最佳參數(shù)（圖4A），打印了用于傷口敷料的多層水凝膠支架。結(jié)果顯示，優(yōu)化的印刷條件下可以獲得更高的均勻性，不同線距或圖案的支架表現(xiàn)出不同的機(jī)械性能。評(píng)估了印刷水凝膠支架的壓縮模量及其機(jī)械穩(wěn)定性。

用含有2.5 wt.%的海藻酸鈉和8.0 wt.%的明膠的水凝膠溶液打印具有不同孔隙率的支架,具有不同孔隙率的支架表現(xiàn)出不同的機(jī)械性能。如圖4B所示，每個(gè)支架都被一對(duì)鑷子夾住，以證明明顯的轉(zhuǎn)移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，印刷的不均勻水凝膠支架由于其不均勻的機(jī)械強(qiáng)度而未能保持原始的片狀結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證支架的機(jī)械性能，分別對(duì)間距為 0、0.8、1.0 和 1.2 mm 的水凝膠支架和蜘蛛網(wǎng)形狀的支架進(jìn)行了計(jì)算模擬（圖4C））。結(jié)果表明，不同線距或圖案的支架表現(xiàn)出不同的機(jī)械性能。不均勻支架組位移最大，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

隨后進(jìn)行了拉伸試驗(yàn)，并確定了支架的彈性模量（圖4D，E）。如圖4E所示，間距為0、0.8、1.0、1.2mm的腳手架、蜘蛛網(wǎng)狀腳手架和不平整腳手架的彈性模量分別為0.639、0.278、0.266、0.241、0.461和 0.043 MPa。根據(jù)之前的發(fā)現(xiàn)，除了不均勻的水凝膠支架外，所有的水凝膠支架都具有與皮膚的彈性模量相匹配的彈性模量，以確保它們是治療皮膚傷口的合適候選者。最后評(píng)估了印刷水凝膠支架的壓縮模量及其機(jī)械穩(wěn)定性（圖4F）。測(cè)試在新打印的支架和打印后儲(chǔ)存7天的支架上進(jìn)行，結(jié)果表明，線間距為0mm和0.8 mm的支架比不平整結(jié)構(gòu)組和間距為1.0和1.2 mm的支架具有更高的抗壓模量。

這些結(jié)果共同表明，在優(yōu)化條件下打印的水凝膠支架表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。

圖4 在優(yōu)化的打印條件和未優(yōu)化的打印條件下制造多層水凝膠支架

4. 水凝膠支架的體內(nèi)外療效評(píng)價(jià)
為了評(píng)估打印的水凝膠支架的細(xì)胞相容性，使用CCK-8測(cè)定法和免疫熒光法，測(cè)定與水凝膠浸泡的培養(yǎng)基一起孵育的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞 (HaCaT) 細(xì)胞的活力。發(fā)現(xiàn)暴露于不同濃度的水凝膠浸泡介質(zhì)的HaCaT細(xì)胞在 24 小時(shí)顯示>90%的高存活率（圖5A、B）。上述結(jié)果表明水凝膠的成分對(duì)細(xì)胞可能無(wú)害。

為了進(jìn)一步評(píng)估印刷水凝膠支架上細(xì)胞的增殖，使用 CCK-8 測(cè)定法確定了與支架一起孵育的NIH/3T3成纖維細(xì)胞的活力（圖 5C）。發(fā)現(xiàn)暴露于支架的成纖維細(xì)胞在第3天和第5天（與第1天相比）顯示 > 100% 的相對(duì)活力，表明支架可以有效地支持細(xì)胞增殖。

此外，使用體外劃痕試驗(yàn)研究了印刷水凝膠支架上的細(xì)胞遷移行為（圖5E、F）。結(jié)果表明，劃痕在細(xì)胞遷移的作用下逐漸閉合。

圖5 打印的水凝膠支架的體外細(xì)胞評(píng)估

為了評(píng)估印刷水凝膠支架對(duì)糖尿病傷口愈合的治療性能，進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。在每只糖尿病大鼠的背部打一個(gè)全層皮膚缺損處，然后用印有不同結(jié)構(gòu)的水凝膠支架覆蓋，記錄不同敷料的傷口閉合過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水凝膠支架覆蓋的傷口比對(duì)照組的傷口愈合率更高，未進(jìn)行任何治療的對(duì)照組在第7天和第14天均表現(xiàn)出更高水平的炎癥（圖6）。

圖6 印刷水凝膠支架在大鼠糖尿病傷口愈合中的應(yīng)用

在這項(xiàng)工作中，成功建立了一種新型 AI-HTPCSS，用于快速篩選 3D 擠出生物打印機(jī)和生物材料墨水的給定組合的 3D生物打印參數(shù)�；�于AI-HTPCSS，可以很容易地獲得用于擠出高保真水凝膠長(zhǎng)絲的優(yōu)化打印參數(shù)（例如，打印壓力、移動(dòng)速度和打印距離），而傳統(tǒng)的打印條件優(yōu)化策略難以實(shí)現(xiàn)。在篩選出的優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，將具有不同結(jié)構(gòu)的多層網(wǎng)格圖案水凝膠支架打印為糖尿病傷口敷料。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，線距為0.8 mm的支架和蜘蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更好的生物學(xué)性能，可有效加速糖尿病傷口的愈合。上述結(jié)果驗(yàn)證了該方法在篩選生物打印條件方面的可行性，表明其在指導(dǎo)制造3D生物打印組織工程支架和可能含有細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)方面的潛在價(jià)值。最后，AI-HTPCSS 有望為（生物）制造過(guò)程提供有用的指導(dǎo)，并加速將3D生物打印技術(shù)用于擴(kuò)展到生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

文章來(lái)源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202201843