3D打印可被超聲激振的生物支架加速骨再生

來源： EFL生物3D打印與生物制造

物理刺激對細胞培養(yǎng)的應用顯示出調節(jié)多種細胞功能的潛力，包括遷移、分化和存活。然而，這些體外模型在體內外實際的應用潛力取決于物理刺激是否可以外用，而無需侵入性的刺激手段。針對這一要求，荷蘭馬斯特里赫特大學梅林技術啟發(fā)再生醫(yī)學研究所的Lorenzo Moroni教授團隊提出了一種3D打印的動態(tài)雙面支架，該支架可用外部超聲波激活納米振動，并傳遞到周圍的細胞，調控細胞功能性表達，從而實現骨再生，相關工作“Janus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration” 發(fā)表在Nature Communication雜志上。研究人員調控可生物降解的聚己內酯（PCL）和聚乳酸（PLA）共混物中的相對比例，通過相分離自發(fā)形成雙面結構（圖1），利用3D打印技術制備所需宏觀三維結構，由于PCL和PLA不同的生物相容性和聲學響應性分別作為背襯材料和活性材料，從而形成一個超聲換能器（超聲到機械振動）。這樣就可以實現非接觸式物理刺激的感應與傳遞，將超聲的聲頻轉變?yōu)橹Ъ艿臋C械撓度形變，從而影響細胞增殖、分化以及蛋白表達等行為。該研究發(fā)現，經超聲刺激的支架表面的細胞表現出更顯著的成骨分化，具有更高的成骨標志物表達和更高的基質蛋白I型膠原和纖維連接蛋白沉積。另外，研究人員還發(fā)現這種分化增強與細胞上的電位門控鈣離子通道的形成增強以及進一步激活有關。

圖1 雙面結構的3D打印制備過程

在支架的制備過程中，研究人員首先選擇了兩種廣泛使用的可生物降解和生物相容性的聚合物--聚已內酯(PCL)和聚乳酸(PLA)，按照一定的比例將其混合制成纖維狀顆粒，再通過熔融沉積3D打印的方式，將材料擠出打印成支架結構。由于PCL和PLA之間沒有良好的相互作用，因此他們不互溶，形成分離的兩相，該過程出于材料本身的性質，故能自發(fā)形成。通過調節(jié)PCL和PLA的相對比例，研究人員發(fā)現，當PCL和PLA以1：1的比例混合時，打印的支架結構纖維內部可以看到明顯的相分離界面，兩相可以較為清楚和獨立地分開，如圖1b所示。

為了使打印的支架雙面結構化身為可超聲激活的動態(tài)機械支架，研究人員選擇了不同頻率的超聲波來評估不同組分（Janus，PCL，PLA）支架的最佳偏轉，以觸發(fā)細胞反應，如圖2所示。結果顯示，聲波的偏轉在較高聲頻和較軟的材料下減弱，PCL相較PLA質地更軟。而單獨分析這些材料時，較低的偏轉振幅(較高的頻率)導致了相對于未受刺激培養(yǎng)的更高的增殖。

圖2 超聲波遠程驅動支架結構的微納振動以及對細胞行為的影響

為了評估外部超聲刺激3D打印支架實現骨再生的潛力，我們在Janus、PCL和PLA支架上培養(yǎng)hBMSCs 21天，在成骨培養(yǎng)基中，靜態(tài)(0 kHz)和刺激(40 kHz, 30分鐘/天)條件下。培養(yǎng)21天后，在受刺激的Janus支架上形成致密的I型膠原網絡(圖3a)，而受刺激的PCL、PLA或任何靜態(tài)培養(yǎng)條件只顯示細胞內表達。與刺激PLA或任何靜態(tài)條件相比，在受刺激的Janus和PCL材料上培養(yǎng)的細胞上，在基因水平上也檢測到了I型膠原、RunX2和骨鈣素的上調(圖3b)，而在Janus支架上的上調更為明顯。此外，Janus支架上沉積的礦物呈圓形多孔形態(tài)，這通常屬于無定形羥基磷灰石或磷酸鈣。在骨礦化過程中，無定形和球形的磷酸鈣礦化形成碳酸化羥基磷灰石，這表明Janus支架具有骨形成潛能（圖3d）。ATP釋放是機械刺激下成骨細胞反應的關鍵調節(jié)因子，在受刺激的Janus支架上培養(yǎng)的hBMSCs比其他任何受刺激或靜態(tài)條件下培養(yǎng)的hBMSCs高4倍。在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中，在2D間充質干細胞培養(yǎng)過程中，在直接低強度超聲刺激下，ATP釋放增加，并導致細胞膜去極化，這與我們在這里觀察到的結果一致(圖3)。

圖3 Janus支架在遠程超聲刺激下促進hBMSCs成骨分化

細胞膜去極化，作為機械刺激的結果，導致電位門控鈣離子通道(VGCC)的激活，以調節(jié)鈣流入細胞。為了確定L-VGCCs是否參與成骨分化，我們評估了編碼L-VGCC亞基Cav1.2的CACNA1c基因的表達;我們發(fā)現CACNA 1c在受刺激的Janus支架上上調了3倍，而在受刺激的PCL或PLA支架上則沒有上調(圖4a)。在分化過程中，用硝苯地平阻斷L-VGCC，發(fā)現材料和培養(yǎng)條件下都導致細胞數量減少，但在刺激條件下更明顯。阻斷L-VGCC還導致I型膠原、RunX2和骨鈣素基因表達下調，導致刺激和靜態(tài)培養(yǎng)條件下無顯著差異(圖5d)。因此，當LVGCC被阻斷時，超聲刺激不再影響細胞的分化或增殖，證明了二者的直接相關性。

綜上，該研究提出了一種外部超聲波遠程控制支架動態(tài)振動以誘導細胞行為的方案，PCL和PLA支架分別以阻尼材料和偏轉材料的形式響應超聲，而這兩種材料的組合將導致更短的脈沖寬度和更小的偏轉。Janus支架的刺激會增加hBMSCs的細胞增殖，以及成骨標志物的表達和沉積。因此，遠程激活Janus支架是傳統靜態(tài)植入的理想選擇，可以提供細胞的指令刺激，該研究展示了體外模型在植入體內接受外部刺激的應用潛力。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-021-21325-x