《Nature Communications》：“生物3D打�。�”策略用于難愈合骨缺損的治療

來源： EFL生物3D打印與生物制造

難愈合骨缺損（超過臨界尺寸的節(jié)段骨和骨質(zhì)疏松骨缺損等）由于內(nèi)源細(xì)胞的遷移受限或再生潛能較弱，無法自行愈合，其修復(fù)與功能重建是臨床上一個(gè)棘手的問題。由生物材料和健康細(xì)胞構(gòu)成的組織工程骨替代物為解決這一問題帶來了新的希望。盡管過去二十年骨組織工程取得了巨大進(jìn)展，但仍未解決體外培養(yǎng)耗時(shí)且無法精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞分布等難題。擠出式生物3D打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的精準(zhǔn)投遞，為個(gè)性化定制材料-細(xì)胞復(fù)合體提供有效途徑。然而，如何平衡擠出打印過程細(xì)胞活性和支架力學(xué)穩(wěn)定性方面的難題，既保證3D打印技術(shù)的精準(zhǔn)度和支架尺寸，同時(shí)還能維持負(fù)載細(xì)胞高存活率，具有較大的挑戰(zhàn)性。

為了解決這一難題，來自中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院阮長順團(tuán)隊(duì)受到心臟搏動(dòng)泵血的啟發(fā)，提出了一種力學(xué)輔助的“生物3D打印＋”新策略，首先結(jié)合3D打印構(gòu)建了具有力學(xué)響應(yīng)的大尺寸復(fù)雜結(jié)構(gòu)的中空纖維水凝膠支架，然后利用支架力學(xué)響應(yīng)性能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞快速、均勻、精準(zhǔn)及友好地加載�；�于該策略所獲得的細(xì)胞負(fù)載支架，有效地促進(jìn)了難愈合骨缺損的修復(fù)與功能重建。該策略有效解決了當(dāng)前擠出式生物3D打印過程中如何平衡細(xì)胞活性和支架力學(xué)穩(wěn)定性方面的難題，為組織工程與再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供新的思路。

相關(guān)研究成果以“A mechanical-assisted post-bioprinting strategy for challenging bone defects repair”為題于2024年4月26日發(fā)表在《Nature Communications》上。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容   

本研究制備了一種可以對(duì)力學(xué)刺激做出可逆響應(yīng)的心臟啟發(fā)式結(jié)構(gòu)高度可調(diào)的中空纖維水凝膠支架（HHS），可實(shí)現(xiàn)快速、均勻、精準(zhǔn)及友好地負(fù)載。采用甲基丙烯�；�明膠、納米粘土和N-丙烯酰甘氨酰胺的混合墨水，通過一步式同軸打印，在無任何內(nèi)核支撐材料的情況下，實(shí)現(xiàn)高保真度和大尺寸HHS的構(gòu)建，且HHS具有均勻完整且結(jié)構(gòu)高度可調(diào)的中空纖維。HHS表現(xiàn)出出色的彈性、快速的形狀恢復(fù)和優(yōu)異的疲勞抗性，在壓縮應(yīng)變達(dá)80%下可以快速恢復(fù)，并且壓縮循環(huán)1萬次后仍能保持完整的結(jié)構(gòu)。此外，通過壓縮應(yīng)變、循環(huán)次數(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其力學(xué)響應(yīng)行為的調(diào)控。HHS的力學(xué)響應(yīng)行為使其在力學(xué)刺激下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的快速（4 s）、精準(zhǔn)和分區(qū)負(fù)載。與靜態(tài)條件下相比，HHS負(fù)載細(xì)胞數(shù)量提高了13倍。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了負(fù)載細(xì)胞的HHS對(duì)大鼠節(jié)段性和骨質(zhì)疏松骨缺損的修復(fù)效果。結(jié)果表明，負(fù)載細(xì)胞的HHS展現(xiàn)出令人滿意的治愈效果�？偟膩碚f，本研究工作為細(xì)胞和生物材料的功能組裝提供了一種新的、通用的、高效的途徑，推動(dòng)組織工程及細(xì)胞治療用于再生醫(yī)學(xué)。

【大尺寸復(fù)雜結(jié)構(gòu)HHS構(gòu)建】
本研究基于同軸3D打印，在沒有任何內(nèi)核支撐材料的情況下，一步法直接構(gòu)建大尺寸復(fù)雜形狀的組織工程骨（圖1a, b）。采用具有優(yōu)異打印性、足夠力學(xué)強(qiáng)度及生物相容性的甲基丙烯�；�明膠/硅酸鋰納米粘土/ N -丙烯酰甘氨酰胺復(fù)合材料作為打印墨水，經(jīng)同軸針頭的外殼擠出后紫外光照射固化，獲得具有高保真度穩(wěn)定形狀的HHS，可以懸浮在水中，中空通道清晰可見（圖1c），表明構(gòu)建具有中空結(jié)構(gòu)的HHS可行性。

圖1 “生物3D打印＋”策略及組織工程骨支架構(gòu)建示意圖

【中空結(jié)構(gòu)和網(wǎng)格可調(diào)的HHS】

HHS的中結(jié)構(gòu)和網(wǎng)格具有高度可調(diào)控性。如圖2a所示，研究者定義了HHS中空纖維內(nèi)徑和外徑（分別為d和D）、同層兩根中空管之間的最近距離（L）、中空纖維的空間體積（V1）以及網(wǎng)格內(nèi)部的體積（V2）。如圖2b,c和d所示，可以清晰地觀察到光滑均勻的空心管，空心結(jié)構(gòu)完整以及高保真度的網(wǎng)格，其L、D和D具有廣泛的可調(diào)性。通過GeSiM Robotics軟件可以輕松調(diào)節(jié)Lx，而通過調(diào)節(jié)同軸噴嘴的內(nèi)外尺寸可以調(diào)節(jié)中空管的Dy（y范圍為0.4 ~ 0.8 mm）、dz（z范圍為0 ~ 0.6 mm）和壁厚Dy - dz（0 ~ 0.4 mm），從而調(diào)控HHS的性能，表明研究團(tuán)隊(duì)打印的HHS具有出色的可設(shè)計(jì)性。

圖2 HHS可調(diào)的中空結(jié)構(gòu)和網(wǎng)格

【HHS的可壓縮性、彈性、形狀恢復(fù)性和疲勞抗性】

HHS具有優(yōu)異的壓縮性和回彈性，快速的形狀恢復(fù)以及優(yōu)異的抗疲勞性能。研究者進(jìn)一步通過壓縮和循環(huán)壓縮實(shí)驗(yàn)，全面研究了中空纖維內(nèi)徑d對(duì)HHS力學(xué)行為的影響。隨著d的增加，HHs的壓縮強(qiáng)度和彈性提高，即使在80%的應(yīng)變后仍然保持完整且可以恢復(fù)到初始狀態(tài)（圖3a）。此外，研究者通過螢光液體直觀地呈現(xiàn)了HHS的壓縮恢復(fù)速度，一個(gè)周期的壓縮和形態(tài)恢復(fù)僅需要4 s，且1 s內(nèi)即可快速恢復(fù)，與心臟收縮和舒張搏動(dòng)相似。隨后，在應(yīng)變?yōu)?0%的情況下，驗(yàn)證了HHS的可重復(fù)性和抗疲勞性（圖3c,d）。無中空結(jié)構(gòu)的支架在102個(gè)循環(huán)后發(fā)生了嚴(yán)重的損傷，而HHS在104個(gè)循環(huán)后保持結(jié)構(gòu)完整。結(jié)果表明，HHS具有優(yōu)異的抗疲勞性能。

圖3 HHS的力學(xué)性能

【HHS的力學(xué)響應(yīng)性】

HHS具有力學(xué)響應(yīng)行為，能夠快速響應(yīng)外界力學(xué)的刺激。研究者為了進(jìn)一步研究其力學(xué)響應(yīng)性，將HHS浸泡在有或無力學(xué)刺激的水中，如圖4a、b所示，在沒有力學(xué)刺激的情況下，其吸水能力取決于網(wǎng)格而不是GLN水凝膠的溶脹或HHS的中空結(jié)構(gòu)（圖4c）。此外，HHS吸水率隨應(yīng)變和循環(huán)次數(shù)的增加而顯著增加，而不含V1的HHS吸水率則保持恒定（圖4d-f）。此外，L和d也會(huì)顯著影響HHS水吸收。此外，在20%和40%的應(yīng)變下，吸水率隨循環(huán)次數(shù)的增加而顯著增加（圖4f）。由此可見，在動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激下，V1使得HHS具有良好的力學(xué)響應(yīng)能力，且隨著d、應(yīng)變和循環(huán)次數(shù)的增加，其力學(xué)響應(yīng)能力增強(qiáng)。

圖4 HHS的力學(xué)響應(yīng)性

【HHS快速、均勻、精準(zhǔn)及友好負(fù)載細(xì)胞的能力】

本研究基于HHS的快速壓縮恢復(fù)能力和優(yōu)異的力學(xué)響應(yīng)性，開發(fā)了一種力學(xué)輔助的“生物3D打�。�”策略，以實(shí)現(xiàn)快速、均勻、精確和友好的細(xì)胞負(fù)載。如圖5a,b所示，與靜態(tài)條件相比，4 s內(nèi)HHS負(fù)載的細(xì)胞數(shù)量顯著提高了約13倍，這表明V1 -力學(xué)響應(yīng)途徑的主動(dòng)性和有效性。培養(yǎng)3 d后，HHS中細(xì)胞分布均勻且增殖明顯。同時(shí)，HHS中負(fù)載細(xì)胞的數(shù)量隨著壓縮應(yīng)變（圖5c）或循環(huán)次數(shù)（圖5d）的增加而增加，表明研究者提出的策略具有可控制性。在傳統(tǒng)的組織工程中，無法將多種類型的細(xì)胞分區(qū)引入到支架中。在本研究中，利用V1和V2之間不同的力學(xué)響應(yīng)性，可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞的精確分區(qū)負(fù)載。如圖5ei所示，研究者進(jìn)一步開發(fā)了一種簡單的V2-力學(xué)響應(yīng)途徑，與直接接種細(xì)胞相比，細(xì)胞均勻分布在整個(gè)HHS的V2中（表面-中間-底部）（圖5eii,eiii）且HHS的V2中的數(shù)量提高了約200%（圖5eiv）。如圖5f所示，通過V1+V2-力學(xué)響應(yīng)的連續(xù)過程，實(shí)現(xiàn)了兩種細(xì)胞分區(qū)負(fù)載于在V1和V2中。此外，HHS可維持內(nèi)皮細(xì)胞表型和促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化（5g,h）。

圖5 HHS力學(xué)響應(yīng)負(fù)載細(xì)胞

【負(fù)載細(xì)胞的HHS修復(fù)難愈合骨缺損】

本研究進(jìn)一步評(píng)估了負(fù)載細(xì)胞的HHS修復(fù)大鼠臨界節(jié)段性骨缺損和骨質(zhì)疏松骨缺損的能力。對(duì)于大鼠大尺寸節(jié)段性骨缺損的修復(fù)（圖6），負(fù)載細(xì)胞的HHS相比于空白和HHS組術(shù)后6周顯著促進(jìn)周圍新生血管的形成，術(shù)后12周在股骨缺損的近端和遠(yuǎn)端形成橋接，且負(fù)載細(xì)胞的HHS新生骨量可達(dá)到HHS組的2.5倍。在大鼠骨質(zhì)疏松骨缺損修復(fù)方面，術(shù)后4周和8周負(fù)載細(xì)胞的HHS組相比于空白和HHS組同樣呈現(xiàn)更為優(yōu)異的骨再生能力（圖7）。研究表明，對(duì)于難愈合骨缺損而言，結(jié)合細(xì)胞的HHS在骨缺損的修復(fù)與功能重建方面顯示出令人滿意的治療效果。

圖6 負(fù)載細(xì)胞的HHS修復(fù)大鼠大尺寸節(jié)段骨缺損的研究

圖7 負(fù)載細(xì)胞的HHS修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損的研究

2. 總結(jié)與展望
總之，本研究通過一種簡單的一步同軸打印方法，在無內(nèi)核支撐材料的情況下，成功3D打印制備了一系列中空纖維結(jié)構(gòu)高度可調(diào)的大尺寸復(fù)雜結(jié)構(gòu)HHS。所得到的HHS表現(xiàn)出優(yōu)異的彈性、快速的形狀恢復(fù)和出色的疲勞抗性，并顯示出可控的力學(xué)響應(yīng)行為。利用HHS力學(xué)響應(yīng)性能可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞快速、均勻、精準(zhǔn)及友好地加載。所獲得的細(xì)胞負(fù)載HHS，有效地促進(jìn)了難愈合骨缺損的修復(fù)與功能重建，推進(jìn)了組織工程在骨再生領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究提出的力學(xué)輔助“生物3D打�。�”新策略，有效解決了當(dāng)前擠出式生物3D打印過程中難以平衡細(xì)胞活性和支架力學(xué)穩(wěn)定性方面的難題，為細(xì)胞和生物材料的功能組裝提供了一種新的、通用的、高效的途徑，推動(dòng)組織工程及細(xì)胞治療用于再生醫(yī)學(xué)。

文章來源：https://doi.org/10.1038/s41467-024-48023-8