多功能3D打印支架通過(guò)微波熱化學(xué)療法結(jié)合免疫療法根除骨肉瘤并促進(jìn)骨生成

來(lái)源： EngineeringForLife

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是全球兒童和青少年中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤。雖然確診為原發(fā)性疾病的患者 5 年生存率為 60%-70%，但復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病例的預(yù)后明顯惡化，生存率降至約 20%。盡管為提高 OS 患者的無(wú)病生存率做出了大量努力，包括化療和手術(shù)相結(jié)合，但由于腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，5 年生存率在過(guò)去 30 年中基本保持不變。因此，治療 OS 迫切需要開(kāi)發(fā)其他有效的治療策略。免疫療法通常需要調(diào)動(dòng)患者的免疫反應(yīng)，這在過(guò)去幾年中改變了癌癥治療的模式。最近，吲哚胺 2,3-二氧化酶（IDO）因其調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的特殊功能而成為癌癥免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。IDO 的過(guò)度表達(dá)和犬尿氨酸在腫瘤組織中的積累可抑制 CD8+ T 細(xì)胞的功能，同時(shí)通過(guò)與芳基烴受體結(jié)合激活調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞。雖然基于 IDO 抑制劑的治療模式已被證實(shí)可獲得安全和滿意的療效，但由于腫瘤的免疫原性有限且免疫浸潤(rùn)較低，導(dǎo)致免疫治療效果不佳，因此很少有 OS 患者能完全從治療中獲益。腫瘤復(fù)發(fā)和骨組織缺乏整合是骨肉瘤手術(shù)治療中的兩大關(guān)鍵問(wèn)題。因此，高效治療骨肉瘤迫切需要一種先進(jìn)的多功能治療平臺(tái)，既能消除殘余腫瘤細(xì)胞，又能促進(jìn)骨再生。

為了徹底消除腫瘤并同時(shí)促進(jìn)骨再生，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所的孟憲偉、Shi Cheng和Yu Zhang團(tuán)隊(duì)將微波響應(yīng)的沸石咪唑框架8（ZIF-8）納米材料與一種化療藥物和一種免疫檢查點(diǎn)抑制劑整合到3D打印的鈦支架上，從而設(shè)計(jì)出一種智能多功能治療支架。所構(gòu)建的支架具有明顯的微波熱敏性和腫瘤微環(huán)境響應(yīng)特性，可通過(guò)微波熱療和化療誘導(dǎo)腫瘤免疫原性死亡。納米復(fù)合材料支架的異位植入可增強(qiáng)對(duì)骨肉瘤的免疫反應(yīng)，通過(guò)協(xié)同免疫療法有效抑制腫瘤復(fù)發(fā)。在長(zhǎng)期植入過(guò)程中，ZIF-8 降解釋放的鋅離子可誘導(dǎo)干細(xì)胞的成骨分化。3D打印鈦支架的多孔結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能為骨再生提供了結(jié)構(gòu)性微環(huán)境。這項(xiàng)研究為設(shè)計(jì)用于治療骨肉瘤的多功能微波響應(yīng)復(fù)合支架提供了一個(gè)范例，從而可改進(jìn)該疾病的治療策略。相關(guān)工作以題為“Multifunctional 3D-printed scaffolds eradiate orthotopic osteosarcoma and promote osteogenesis via microwave thermo-chemotherapy combined with immunotherapy”的文章發(fā)表在2023年7月18日的國(guó)際知名期刊《Biomaterials》。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
本研究用一步法合成了ZIF-8@DOX（ZD），先在ZD表面負(fù)載DOX，再負(fù)載IDO抑制劑，合成ZIF-8@DOX-IDO（ZDI）。然后將 ZDI 與3D打印的鈦支架整合形成 TZDI（圖 1）。TZDI 的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（圖 1b 和 c）顯示，通過(guò)3D打印獲得的支架網(wǎng)絡(luò)具有精心設(shè)計(jì)的微觀結(jié)構(gòu)和粗糙的表面。放大后，可以觀察到大量 ZDI 集成在支架上。透射電子顯微鏡（TEM）觀察到的 ZDI 尺寸約為 110 nm（圖 1c），而動(dòng)態(tài)光散射（DLS）檢測(cè)到的水合顆粒尺寸約為 146 nm（圖 1d），這主要是由于 DLS 檢測(cè)時(shí)納米顆粒表面的水膜造成的。通過(guò) DLS（圖 1e）測(cè)定的 ZIF-8（Z）、ZD 和 ZDI 的水合粒徑分別為 115、135 和 146 nm，證實(shí)了它們的成功合成。Z、ZD 和 ZDI 的ζ電位分別為 32.9、11.1 和 3.1 mV（圖 1f）。X 射線衍射圖樣被進(jìn)一步用來(lái)表征合成 ZD 的晶體結(jié)構(gòu)。傅里葉變換紅外光譜進(jìn)一步驗(yàn)證了 ZD 的有效結(jié)構(gòu)。在 ZD 中觀察到了 ZIF-8 中咪唑 N-H 在 3136 cm-1 處的伸縮振動(dòng)和咪唑環(huán)在 1141 cm-1 處的伸縮振動(dòng)。在 ZD 中還發(fā)現(xiàn)了 DOX 中位于 1728 cm-1 的 C 雙鍵 O 的伸縮振動(dòng)和位于 1624 cm-1 的 C 雙鍵 C 的伸縮振動(dòng)，這表明 ZD 的合成成功。此外，還利用紫外可見(jiàn)光譜（UV-Vis）測(cè)量了 Z、DOX、ZD、IDO 和 ZDI 的吸收光譜（圖 1g）。在 ZD 和 ZDI 中發(fā)現(xiàn)了 DOX 吸收峰，而 IDO 吸收峰僅在 ZDI 中檢測(cè)到，這進(jìn)一步證實(shí)了 ZD 和 ZDI 的理想結(jié)構(gòu)。能量色散 X 射線光譜分析了 TZDI 的化學(xué)成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 Ti、Zn、C、N 和 O 元素的存在，表明 ZDI 與3D打印支架的有效整合。綜上所述，這些結(jié)果表明，通過(guò)將 ZDI 集成到3D打印鈦支架表面，成功合成了 TZDI。

圖1 基于沸石咪唑酯骨架8（ZIF）的多功能藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建

由于 ZDI 在體外具有優(yōu)異的 MW 熱敏性和藥物控釋性能，因此有望在治療 OS 方面實(shí)現(xiàn)顯著的 MW 熱化學(xué)療法。因此，本研究對(duì)其抑制 OS 細(xì)胞生長(zhǎng)的能力進(jìn)行了評(píng)估。首先，評(píng)估了 ZDI 的體外抗腫瘤效果（圖 2）。采用典型的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)不同納米系統(tǒng)（正常對(duì)照[NC]、Z、ZD、ZDI、NC + MW、Z + MW [ZM]、ZD + MW [ZDM]和 ZDI + MW [ZDIM]）與小鼠 OS 細(xì)胞株 K7M2 共培養(yǎng) 1、3 和 7 d 的細(xì)胞活力。結(jié)果表明，在同一時(shí)間點(diǎn)，與非 MW 組相比，MW 組 K7M2 的存活率明顯降低（p < 0.001），這可能是由于 MWA 引起的溫度升高所致。封裝在納米系統(tǒng)中的 DOX 可在 MW 照射下釋放到細(xì)胞內(nèi)殺死 K7M2，從而導(dǎo)致 ZDM 組和 ZDIM 組 K7M2 的存活率隨時(shí)間而降低。結(jié)果表明，與單獨(dú)使用 MW 或 ZDI 相比，將 MW 熱療與使用納米藥物的化療相結(jié)合能更有效地殺死 K7M2 癌細(xì)胞。

圖2 不同納米復(fù)合支架系統(tǒng)的抗腫瘤效果評(píng)估

DOX 是一種免疫原性化療藥物，可誘導(dǎo) ICD，進(jìn)而刺激 T 細(xì)胞抗腫瘤免疫。免疫原性化療藥物可以上調(diào)癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的 IDO（一種關(guān)鍵的免疫抑制劑），從而阻礙免疫細(xì)胞的功能，從而極大地抵消基于免疫原性化療的癌癥療法的治療效果。因此，在腫瘤治療中，DOX 與 IDO 抑制劑的聯(lián)用具有重要意義，它既能誘導(dǎo) DOX 的化療殺傷作用，又能避免 IDO 的免疫抑制作用。癌細(xì)胞的 ICD 伴隨著一系列特征性變化，包括細(xì)胞膜上出現(xiàn) CRT、HMGB-1 暴露、骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDC）活化、分泌 IFN-γ 的 T 細(xì)胞的抗腫瘤免疫激活等。因此，這些經(jīng)典指標(biāo)可用于確定 ZDI 是否能在體外誘導(dǎo) ICD。如圖 3 所示，CRT 和 HMGB-1 都是經(jīng)典的免疫原性物質(zhì)，其功能可調(diào)節(jié)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子的生物合成，并參與各種炎癥反應(yīng)，其表達(dá)/釋放的增加可被視為免疫原性增強(qiáng)的標(biāo)志。與其他組相比，ZDM 組和 ZDIM 組 CRT 和 HMGB-1 的表達(dá)明顯增加。ZD組和ZDI組中CRT和HMGB-1的增加是由于包封的DOX在MW輻照下部分釋放并隨后對(duì)K7M2細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。這些結(jié)果證明了納米藥物的MW熱療和化療的聯(lián)合作用，其導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫性死亡，進(jìn)而可能促進(jìn)體內(nèi)免疫細(xì)胞的激活。

圖3 不同納米復(fù)合材料支架系統(tǒng)的免疫效應(yīng)體外評(píng)估

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，MW熱化學(xué)療法結(jié)合免疫療法可有效誘導(dǎo)OS細(xì)胞的ICD，從而促進(jìn)抗腫瘤免疫，具有良好的腫瘤治療效果。接下來(lái)，本研究采用Balb/c小鼠股骨OS骨肉瘤模型評(píng)估了TZDI支架的體內(nèi)抗腫瘤療效。具體實(shí)驗(yàn)方案如圖 4所示。對(duì) MW 組小鼠進(jìn)行 MW 照射（1.8 W，5 分鐘）。Z、ZD 和 ZDI 組實(shí)驗(yàn)小鼠的體溫普遍高于單一 MW 組，證實(shí) Z、ZD 和 ZDI 組具有明顯的體內(nèi) MW 熱敏感性。小鼠第0、3、7和14天的照片顯示，Ti@ZD + MW（TZDM）組和Ti@ZDI + MW（TZDIM）組的腫瘤比其他組小，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采集的股骨原位腫瘤也顯示出類似的趨勢(shì)。其中，TZDIM 組誘導(dǎo)的腫瘤體積縮小最為明顯，這表明在 MW 熱療、化療和免疫療法的協(xié)同作用下，TZDIM 組的抗腫瘤效果最強(qiáng)。14 天后小鼠腫瘤體積和重量的減少也證實(shí)了這一結(jié)果；TZDIM 組顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。免疫組化分析進(jìn)一步用于評(píng)估腫瘤組織的免疫狀態(tài)。TZDIM 組小鼠腫瘤組織中 Foxp3 和 IDO 的表達(dá)水平在第 14 天時(shí)最低，表明由于免疫檢查點(diǎn) IDO 被阻斷，免疫抑制作用最弱；而 HMGB-1 和 CD11c 的表達(dá)水平最高，表明其可以有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞的 ICD。

圖4 不同納米復(fù)合材料支架系統(tǒng)的體內(nèi)免疫效應(yīng)評(píng)估

腫瘤引流淋巴結(jié)是成熟的 DC 向 T 細(xì)胞展示捕獲的抗原，從而導(dǎo)致 CD8+ T 細(xì)胞功能性激活抗腫瘤免疫的關(guān)鍵位置。本研究對(duì) Balb/c 小鼠腫瘤引流區(qū)的淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，主要目的是檢測(cè) DC 和 CD8+ T 淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。具體的流式細(xì)胞術(shù)方案如圖 5 所示。結(jié)果顯示，在第七天，TZDIM 組 CD3-CD11c+ （圖 5b）和 CD3+CD8+ （圖 5e）細(xì)胞的比例是各治療組中最高的，這代表了針對(duì)腫瘤的局部免疫反應(yīng)導(dǎo)致了 ICD。此外，還用電子顯微鏡觀察了腫瘤的組織切片。結(jié)果顯示，TZDM 組和 TZDIM 組 OS 細(xì)胞的凋亡和壞死均處于晚期，顯示出明顯的細(xì)胞器損傷。這些研究結(jié)果表明，MW 熱化學(xué)療法與免疫療法相結(jié)合可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的 ICD，并有效激活免疫反應(yīng)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

圖5 不同納米復(fù)合材料支架系統(tǒng)對(duì)免疫細(xì)胞活化的影響

考慮到 Zn2+ 固有的成骨特性，在設(shè)計(jì)工程化多功能復(fù)合 3D 打印支架時(shí)，本研究考慮了加入 Zn2+ 以增強(qiáng)其成骨特性。因此，本研究初步評(píng)估了 ZIF-8 的體外成骨特性（圖 6）。通過(guò) PCR 檢測(cè)的成骨生物標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）、Runx2 和骨鈣素的表達(dá)如圖 6c 所示。在第 7 天和第 14 天，ZIF-8 組的成骨基因表達(dá)明顯高于 NC 組，證實(shí)了成骨分化。測(cè)定 ALP 活性以評(píng)估早期成骨分化。第 7 天，ZIF 組的 ALP 含量略高于 NC 組；但第 14 天，ZIF-8 組的 ALP 含量顯著高于 NC 組。茜素紅染色和相應(yīng)的定量分析也顯示了類似的結(jié)果。這些結(jié)果驗(yàn)證了 ZIF-8 可誘導(dǎo)大鼠 BMSCs 產(chǎn)生強(qiáng)烈的成骨反應(yīng)。此外，BMSCs的細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，ZIF-8組的細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)量和細(xì)胞鋪展度明顯高于NC組，說(shuō)明ZIF-8與大鼠BMSCs的相容性更好，更有利于其粘附和生長(zhǎng)。這些結(jié)果證明，TZDI 支架能為大鼠 BMSCs 的成骨分化提供良好的環(huán)境，誘導(dǎo)更強(qiáng)的成骨反應(yīng)。

圖6 ZIF-8 對(duì)骨生成的影響

通過(guò)將 TZDI 支架植入斯普拉格-道利（SD）大鼠的股骨，本研究評(píng)估了 TZDI 支架的體內(nèi)成骨潛力（圖 7）。4 周和 12 周后，收集樣本進(jìn)行顯微 CT 掃描和重建分析。在圖 7b 中，支架的紅色表面是新骨。與鈦組相比，TZDIM 組有更多的新骨，這表明負(fù)載 ZIF-8 的支架具有更好的生物活性，能誘導(dǎo)新骨生成。此外，BV/TV、Tb-Th、Tb. Sp、Tb-N 和骨礦物質(zhì)密度進(jìn)行了定量分析。BV/TV 是骨組織體積與組織總體積之比，代表骨體積分?jǐn)?shù)，BV/TV 的增加直接反映了新骨形成的增強(qiáng)。Tb。Th 代表骨小梁的平均厚度，而 Tb. N 代表相關(guān)區(qū)域內(nèi)每毫米骨與非骨交叉的平均數(shù)量。Tb. Th和Tb-N的升高表明骨合成比骨分解增強(qiáng)。Tb. Sp 代表骨小梁之間髓質(zhì)空間的平均寬度。Tb. Sp 的減少表明骨量增加，骨結(jié)構(gòu)增強(qiáng)。結(jié)果顯示，ZIF 負(fù)載支架組的這些指標(biāo)明顯高于 Ti 支架組。血紅素和伊紅（H&E）染色結(jié)果見(jiàn)圖 7h，其中黑色部分為支架，紅色部分為新骨。在第 4 周和第 12 周，ZIF 負(fù)載支架組的新生骨量明顯高于 Ti 支架組。用 Masson 三色染色法評(píng)估不同組的骨成熟度。結(jié)果顯示，在第 4 周和第 12 周，TZDI 支架周?chē)�紅色區(qū)域的新骨量高于 Ti 支架組，這也證實(shí)了 ZIF-8 支架加速了新骨的成熟速度。

圖7 TZDI 納米復(fù)合材料支架對(duì)骨生成的體內(nèi)影響

2. 總結(jié)與展望
本研究通過(guò)在3D打印鈦支架上整合負(fù)載有化療藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的 ZIF-8 納米材料，設(shè)計(jì)并制造了一種智能多功能 MW 響應(yīng)復(fù)合支架。這使得高療效的骨肉瘤矯形治療和生物活性更強(qiáng)的骨再生成為可能。支架優(yōu)異的MW熱增強(qiáng)特性實(shí)現(xiàn)了MW熱療法、免疫療法和化療之間的有效協(xié)同。重要的是，MW 熱療和化療通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的 ICD 顯著增強(qiáng)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)。結(jié)合在腫瘤微環(huán)境中釋放的 IDO 抑制劑，BMDCs 和 CD8+ T 淋巴細(xì)胞可被進(jìn)一步共同刺激，從而殺死腫瘤細(xì)胞。值得注意的是，ZIF-8 釋放的 Zn2+ 不僅能促進(jìn) BMSCs 的成骨分化，還能增強(qiáng)體內(nèi)新骨的生成。因此，這種集腫瘤治療與骨再生于一體的多功能支架為OS的術(shù)后治療提供了一種高效的多功能策略。

文章來(lái)源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0142961223002442