生物3D打印的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型模擬細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)性能異質(zhì)性

來源：賽箔生物

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性腦腫瘤，其特點是細(xì)胞和分子的高度異質(zhì)性，血管過密，以及先天的耐藥。細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是GBM中異質(zhì)性的兩個主要來源。本文中，來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的Tariq M. Rana和Shaochen Chen團(tuán)隊的Min Tang等作者開發(fā)了具有腫瘤區(qū)域、無細(xì)胞ECM區(qū)域和內(nèi)皮區(qū)域的仿生物三區(qū)GBM模型，其區(qū)域硬度與GBM基質(zhì)、病理或正常腦實質(zhì)和腦毛細(xì)血管相對應(yīng)。DLP光固化生物3D打印技術(shù)的靈活性和多樣化的材料選擇允許對腫瘤模型的生物物理特性和生化特性進(jìn)行正交調(diào)制。

源于患者的GBM細(xì)胞、人類內(nèi)皮細(xì)胞和透明質(zhì)酸衍生物被用來建立一個人源化的微環(huán)境。這項體外研究表明，生物物理信號參與各種腫瘤細(xì)胞行為和血管生成潛力，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不同分子亞型。硬質(zhì)模型的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與間充質(zhì)亞型相似，腫瘤細(xì)胞呈彌漫性侵襲，并對替莫唑胺展現(xiàn)更高的藥物抗性，同時內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出出芽式血管新生形態(tài)。軟質(zhì)模型表現(xiàn)出經(jīng)典亞型相關(guān)通路的富集，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出擴(kuò)張性細(xì)胞生長。本研究采用光固化生物3D打印技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、靈活和可重復(fù)的具有生物物理異質(zhì)性的患者特異性GBM模型，在未來的研究中可以作為一個可調(diào)控的系統(tǒng)來研究GBM疾病機制和篩選藥物。

3D生物打印的GBM模型具有區(qū)域不同的生物物理特性
為了再現(xiàn)空間上不均勻的ECM微環(huán)境，并探究ECM異質(zhì)性如何影響GBM的發(fā)展和內(nèi)皮細(xì)胞的生長，作者利用DLP 3D生物打印系統(tǒng)和腦瘤特異性ECM衍生的生物墨水，包括GMHA和GelMA，創(chuàng)建四個不同的模型：純腫瘤的硬質(zhì)模型、純腫瘤的軟質(zhì)模型、共培養(yǎng)的硬質(zhì)模型和共培養(yǎng)的軟質(zhì)模型（圖1A）。共培養(yǎng)模型中采用了人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）打印內(nèi)皮區(qū)域，以包圍腫瘤和ECM區(qū)域（圖1B）。對ECM區(qū)域，作者設(shè)計了兩種不同的硬度，以模仿GBM組織的硬度和健康大腦的硬度（圖1C）。作者進(jìn)一步使用這些具有不同機械性能的3D打印GBM模型，進(jìn)行在生物物理信號和培養(yǎng)條件下的評估，包括基因表達(dá)、藥物反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞遷移行為和血管生成活動。（圖1E）。

圖1. 3D生物打印的GBM模型具有區(qū)域性的不同生物物理特性

與球狀體培養(yǎng)相比，3D模型具有不同的轉(zhuǎn)錄特征
主成分分析顯示，球狀體培養(yǎng)與任何一種3D培養(yǎng)相比都有截然不同的轉(zhuǎn)錄譜，而兩種3D培養(yǎng)之間的差異程度較小（圖2A）。一些蛋白編碼的癌癥相關(guān)基因或預(yù)后基因在兩種3D培養(yǎng)條件下都上調(diào)了16倍以上（圖2B，C）。與球狀體相比，與 DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分裂的通路在3D軟質(zhì)模型中明顯富集（圖2D）。

圖2. GBM球狀體培養(yǎng)和3D模型之間不同的轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)

硬質(zhì)模型促進(jìn)了GBM的缺氧和致瘤性特征

與缺氧、癌癥侵襲性、E-cadherin缺失引起的轉(zhuǎn)移，以及對干擾素、炎癥、ECM和細(xì)胞凋亡等外部刺激的反應(yīng)的相關(guān)基因集在硬質(zhì)模型中明顯富集（圖3A，B）。低氧相關(guān)的基因，以及低氧相關(guān)的血管生成標(biāo)志物VEGFA和SPP1在硬質(zhì)模型中都被上調(diào)（圖3C）。免疫熒光（IF）染色顯示，軟質(zhì)模型中存在更多的KI67陽性細(xì)胞（圖3D）。

3D模型誘導(dǎo)不同的GBM侵襲模式和轉(zhuǎn)錄亞型
TS576細(xì)胞和CW468細(xì)胞在軟質(zhì)模型中的侵襲面積分別是硬質(zhì)模型的7倍和4.4倍（圖3F）。與從軟質(zhì)模型中分離出的TS576細(xì)胞相比，從硬質(zhì)模型中分離出的TS576細(xì)胞高度富含原發(fā)性GBM組織特征（圖3G），表明硬質(zhì)模型將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更具有臨床意義的狀態(tài)。

圖3. 生物物理模式化誘導(dǎo)了GBM細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)錄圖譜和侵襲模式

內(nèi)皮細(xì)胞在3D打印的模型中表現(xiàn)出不同的生長模式和血管生成
在硬質(zhì)模型中，遷移的CD31+HUVECs表現(xiàn)出類似出芽的血管新生形態(tài)，并與SOX2+GBM細(xì)胞緊密接觸（圖4A）。血管生成標(biāo)志物SPP1和VEGFA在所有的3D模型中都是上調(diào)的，并且在硬質(zhì)模型或共培養(yǎng)模型中明顯富集（圖4B）。

GBM-內(nèi)皮細(xì)胞交流增強了腫瘤的侵襲和抗藥性
腫瘤細(xì)胞在軟質(zhì)共培養(yǎng)模型中以類纖維細(xì)胞形態(tài)擴(kuò)增，而在硬質(zhì)模型中則以更圓的形態(tài)擴(kuò)增（圖4C）。與球狀體培養(yǎng)的細(xì)胞相比，所有3D生物打印模型中腫瘤細(xì)胞都顯示出對TMZ的耐藥性增強（圖4D）。qPCR分析顯示，耐藥性相關(guān)基因如ABCG2和CXCL12在硬質(zhì)共培養(yǎng)條件下分別上調(diào)了8倍和24倍（圖4E），與TMZ治療反應(yīng)一致。

圖4. 硬質(zhì)模型誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的萌芽血管生成，增強了GBM細(xì)胞的抗藥性

結(jié)論
本研究中，腫瘤區(qū)和內(nèi)皮區(qū)被設(shè)計成具有類似于其原始狀態(tài)的硬度。在腫瘤區(qū)和內(nèi)皮區(qū)之間打印了專門設(shè)計的ECM區(qū)域的兩種硬度條件，以模仿GBM重塑的基質(zhì)或健康的腦實質(zhì)硬度，并誘導(dǎo)不同的腫瘤細(xì)胞生長和行為。細(xì)胞在軟質(zhì)模型中迅速增殖和擴(kuò)增；在硬質(zhì)模型中，與惡性表型有關(guān)的缺氧、干性和血管生成能力得到加強。

腫瘤細(xì)胞在兩種硬度的微環(huán)境中以不同的形態(tài)和模式侵入ECM區(qū)域。硬質(zhì)模型中表現(xiàn)出單細(xì)胞彌漫性侵襲模式，而軟質(zhì)模型中則表現(xiàn)出擴(kuò)張性生長模式。這兩種侵襲模式都在GBM細(xì)胞中被觀察到過，這表明硬度變化模型可能適合模擬GBM發(fā)展的不同狀態(tài)�；�因集富集分析表明，這兩種硬度適合模擬不同的GBM亞型。

血管化是GBM的一個特征，它促進(jìn)了腫瘤的生長，有利于腫瘤的侵襲�；�因表達(dá)顯示，硬質(zhì)模型中的腫瘤細(xì)胞表達(dá)了較高的血管生成標(biāo)志物，與硬質(zhì)模型中觀察到的出芽表型一致。軟質(zhì)模型促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的侵襲面積增大和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

對所有模型和球體培養(yǎng)對照的TMZ用藥處理處理結(jié)果顯示，硬質(zhì)共培養(yǎng)模型的腫瘤細(xì)胞存活率最高，這表明硬質(zhì)條件以及與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)增強了GBM的抗藥性。

本研究中提出的三區(qū)硬度模式的GBM模型是第一個將GBM的生理相關(guān)的生物物理異質(zhì)性與生化相關(guān)的ECM材料相結(jié)合的模型。區(qū)域硬度更好地再現(xiàn)了原生環(huán)境，并可能有利于更多的生物模擬細(xì)胞-ECM和細(xì)胞相互作用。未來可用這些模型來研究GBM的不同亞型以及GBM的不同階段。硬度變化也可應(yīng)用于未來的模型，研究生物物理對其他腫瘤-基質(zhì)相互作用的影響。

原文：https://doi.org/10.1002/smll.202006050