《Biofabrication》：源于GelMA墨水，打印腫瘤類器官

來源： EngineeringForLife

3D體外腫瘤模型對癌癥生物學特征研究和藥物開發(fā)至關(guān)重要。但是目前模擬腫瘤微環(huán)境仍然具有難度，因為腫瘤微環(huán)境是由各種細胞成分和生物因素組成的異質(zhì)性混合物。用于腫瘤組織工程的水凝膠材料缺乏相關(guān)物理性相互作用，無法將細胞釋放的生物活性因子保持在水凝膠內(nèi)并改善旁分泌的相互作用。近日，來自美國寺崎生物醫(yī)學創(chuàng)新研究所Bingbing Li、Hanjun Kim、Ali Khademhosseini教授團隊進行了用于3D生物打印類器官腫瘤模型的甲基丙烯酰化明膠和皂石生物墨水的相關(guān)研究。研究成果以“Gelatin methacryloyl and laponite bioink for 3D bioprinted organotypic tumor modeling”為題于6月22日發(fā)表在《Biofabrication》上。


本文從以下6方面進行系統(tǒng)表征：

1. GelMA/Laponite復合水凝膠可打印性評估

2. 非交聯(lián)GelMA/Laponite復合水凝膠可注射性和流變學評估

3. 載有細胞的GelMA/Laponite復合生物墨水體外生物相容性評估

4. 載有細胞的GelMA/Laponite復合生物墨水體外細胞形態(tài)學評估

5. 使用GelMA/Laponite復合生物墨水進行高通量制造三維生物打印的胰腺癌類腫瘤模型

6. 三維生物打印胰腺癌類腫瘤模型基因和蛋白質(zhì)表達分析

圖1 實驗流程示意圖

本研究開發(fā)了一種納米工程離子共價交聯(lián)的生物墨水，構(gòu)建3D生物打印類器官腫瘤模型。該生物墨水創(chuàng)造了一個由明膠（GelMA）和合成納米硅酸鹽（Laponite）組成的相互滲透網(wǎng)絡(luò)，Laponite是輕度交聯(lián)的聚合物，具有獨特的離子特性，可以促進細胞釋放的生物因子保留，并協(xié)助旁分泌信號傳導。低GelMA（5%）與高Laponite（2.5-3.5%）復合水凝膠和高GelMA（10%）與低Laponite（1.0-2.0%）復合水凝膠3D打印機械性能都在可接受范圍內(nèi)。但是高Laponite含量的低GelMA復合水凝膠無法提供細胞生存能力。隨著Laponite比例的增加，細胞更加聚集，形成更大的3D腫瘤結(jié)構(gòu)。RT-qPCR和Western blot實驗顯示，Laponite比例的增加會誘導腫瘤細胞中生長因子和組織重塑相關(guān)基因以及蛋白質(zhì)的上調(diào)。相反，細胞周期和增殖相關(guān)的基因下調(diào)。另一方面，對于成纖維細胞，Laponite比率的增加也會導致與間質(zhì)相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)整體上調(diào)。

圖2 GelMA/Laponite復合水凝膠可打印性表征

在基于擠壓的生物打印過程中，由于內(nèi)噴嘴直徑、壓力、打印速度、溫度和促凝劑成分等可以控制和影響打印纖維形態(tài)。作為優(yōu)化生物打印過程的第一步，設(shè)定了噴嘴壓力（30G）、溫度（23℃）和打印速度（5毫米/秒）。改變GelMA/Laponite水凝膠的成分，控制打印壓力（50kPa到 80千帕）。將單層結(jié)構(gòu)打印在聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，光學顯微鏡成像顯示隨著Laponite比例的增加，打印出的GelMA/Laponite纖維整體厚度和形狀都在不斷變化。接著，評估了復合水凝膠的可打印性。在0.0-3.5%Laponite與兩種GelMA比例（5%，10%）之間，當GelMA的百分比較低（5%），而Laponite的含量低于2.0%時，粘性就會降低。而低于2.0%時，粘度太低，無法保持幾何形狀。另一方面，當GelMA百分比較高（10%），而Laponite的百分比超過2.5%時，粘度過高，無法擠出。進行打印保真度、物理和化學特性（如流體力學、硬度、溶脹性和降解等）分析都顯示出Laponite對3D生物打印具有積極影響。

圖3 載有細胞的GelMA/Laponite復合水凝膠體外生物相容性以及胰腺癌細胞混入凝膠后形態(tài)學

研究人員為了建立一個癌細胞和基質(zhì)細胞共存類器官腫瘤模型，使用含有腫瘤細胞和基質(zhì)細胞的GelMA/Laponite復合水凝膠進行3D生物打印。接著通過活/死細胞染色（直接存活率）和代謝活動（間接線粒體）來分析了MIA PaCa-2細胞在水凝膠內(nèi)的存活率，培養(yǎng)7天和10天后，復合水凝膠組之間細胞增殖出現(xiàn)差異，但是所有組中都有大量活力旺盛的細胞。高Laponite含量的G5Lx組比單純G5Lx組有相對較少的活細胞。G10Ly組的細胞在3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)增殖長達7天，形成細胞聚集團。而G5Lx組有較少的細胞，而且以分散和不連續(xù)的方式分布。10天后進行線粒體活性分析發(fā)現(xiàn)Laponite會影響細胞生長。6%的Laponite生物墨水可用于3D生物打印小鼠成骨細胞系，并保持7天活力。因此基于Laponite的支架可以作為組織工程的骨架使用。

總結(jié)與展望
本文開發(fā)了一種納米離子共價交聯(lián)的生物墨水，用來構(gòu)建3D生物打印類器官腫瘤模型。Laponite通常用做組織工程中剪切稀化的材料，具有獨特的離子電荷，可以增加組織工程中釋放的生物因子的保留率，并協(xié)助旁分泌信號的產(chǎn)生。本研究結(jié)果中，復合水凝膠與低Laponite具有較高的生物相容性，改善了流體學和機械性能。此外GelMA/Laponite水凝膠有效促進了MIA PaCa-2細胞和成纖維細胞的增殖，提供了一個較好的微環(huán)境。Laponite比率的變化會導致腫瘤相關(guān)基因和成纖維細胞相關(guān)基因的mRNA表達水平的顯著變化。GelMA/Laponite復合生物墨水引起癌細胞的微環(huán)境重塑，并導致基因的上調(diào)，這些基因可以促進脫髓鞘成纖維細胞和CM在3D生物打印類器官腫瘤模型積累�？傊瓽elMA/Laponite復合水凝膠的機械性能可以進行打印，同時該體系能改善腫瘤細胞/間質(zhì)細胞的相互作用，促進細胞的生存、增殖和發(fā)展。該研究未來將大力促進類器官腫瘤模型的構(gòu)建。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ace0db