中國科學院大學：3D打印高保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細胞定向的人造結(jié)締組織

來源： EngineeringForLife

制造具有高打印保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物相容性和細胞定向的結(jié)締組織對于生物墨水仍然是一項挑戰(zhàn)。膠原蛋白，作為提供體內(nèi)強度的固有纖維，是組織打印的理想材料。然而，目前的膠原蛋白-生物墨水表現(xiàn)出較差的可打印性和機械性能。近日，來自中國科學院大學的鄭雄飛教授團隊進行了高保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細胞定向的人造結(jié)締組織3D打印的相關(guān)研究。研究成果以“Bioprinting of light-crosslinkable neutral-dissolved collagen to build implantable connective tissue with programmable cellular orientation”為題于2023年04月12日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 光交聯(lián)中性溶解膠原蛋白生物打印實現(xiàn)打印保真、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性和細胞定向

本文開發(fā)了一種可光交聯(lián)降冰片-膠原蛋白（NorCol），具有完整膠原蛋白結(jié)構(gòu)的NorCol表現(xiàn)出出色的剪切稀化性能和光交聯(lián)強度，能夠?qū)崿F(xiàn)復雜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，具有良好的打印保真度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。不同濃度中性溶解的NorCol直接集成到打印具有復合模量的純膠原蛋白結(jié)構(gòu)中，具有較強生物相容性，模仿細胞外基質(zhì)（ECM）異質(zhì)微結(jié)構(gòu)。該復合結(jié)構(gòu)在皮下移植時對宿主組織和毛細血管進行廣泛滲透。通過設計印刷絲緊密接口，構(gòu)建了幾何指導和模量無關(guān)的各向異性機械環(huán)境，實現(xiàn)細胞定向。此外，細胞取向與打印高濃度NorCol方向一致，這與體內(nèi)細胞和膠原纖維情況相同。NorCol的這種能力為打印基于純ECM蛋白的、可植入的和功能性的構(gòu)造物開辟了新天地，適用于人類應用的結(jié)締組織工程。

圖2 NorCol具有完整的膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出強剪切稀化性能、光交聯(lián)強度、可打印性和打印保真度

預水凝膠的剪切稀化特性使其很容易從噴嘴中噴出不會發(fā)生物理堵塞，預水凝膠的自愈特性使其在擠出后保持連續(xù)的絲狀，并在沉積后保持其形狀，形成一個具有高保真度的整體結(jié)構(gòu)。HiNorCol的粘度顯示隨著濃度的增加，粘度迅速增加。由于剪切率的增加，所有濃度都觀察到剪切變薄的現(xiàn)象。流變學研究證實NorCol溶液的自愈特性。應用高剪切應變（400%）導致NorCol溶液被完全破壞，使溶液變成了彈性下降（G′）的液體狀態(tài)。這種自我修復的行為可能是由于膠原蛋白分子之間的非共價相互作用的快速和可逆的重建。HiNorCol更接近于固體水凝膠，在靜態(tài)狀態(tài)下表現(xiàn)出形狀保持性能。在剪切力作用下，NorCol迅速轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w特性，并在剪切力消除后迅速恢復為固體特性。這些可調(diào)整的機械性能，與3D打印的分散和積累過程完全匹配。NorCol光交聯(lián)的機械性能顯示對于不同濃度的低度和高度的NorCol（1 w/v%、3 w/v%和5 w/v%），在紫外光照射下，凝膠化轉(zhuǎn)變迅速發(fā)生。NorCol中的光敏基團的程度較低，大分子只需要少量的交聯(lián)點來形成更緊密的網(wǎng)絡就可達到滿意的剪切模量。

圖3 打印脂肪組織的細胞活力、增殖和分化

接下來打印了直徑為10毫米、高度為5毫米（32層）的脂肪組織，以驗證細胞的活力和分化能力。HiNorCol具有良好的結(jié)構(gòu)強度，可以支持大體積組織的形成和連續(xù)培養(yǎng)，但其高粘度和密集的交聯(lián)網(wǎng)絡不適合作為細胞填充材料。使用HiNorCol和LoNorCol的混合打印來實現(xiàn)脂肪組織的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細胞兼容性。脂肪生成或血管形成都需要緊密組織之間的營養(yǎng)交換。本研究使用LoNorCol與3% w/v的明膠作為細胞填充材料。打印頭的溫度控制在18度，打印底板的溫度控制在10度。結(jié)果顯示加入明膠的LoNorCol形成一個絲狀結(jié)構(gòu)，整個結(jié)構(gòu)有明顯的孔隙。培養(yǎng)21天后，打印的結(jié)構(gòu)仍然保持整體完整和精細的結(jié)構(gòu)。Bodipy染色是一種親脂性亮綠色染色劑，可以對非極性脂質(zhì)進行染色，對細胞內(nèi)脂質(zhì)的染色很敏感。結(jié)果顯示染色細胞分布在LoNorCol的內(nèi)部，而HiNorCol的表面只分布有少量的脂質(zhì)滴。進一步證明，與支架表面相比，LoNorCol中的脂肪生成分化表現(xiàn)出數(shù)量和穩(wěn)定性的優(yōu)勢。為了評估打印BMSCs的分化，還分析了組織特異性基因的表達。與基本培養(yǎng)基相比，當BMSCs在成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，觀察到成脂主調(diào)控因子PPARγ的表達明顯增加，同時早期成脂標志物LPL也有增加，結(jié)合油紅O和Bodipy的染色結(jié)果，細胞分化為脂肪組織的趨勢是明顯的。

圖4 誘導細胞取向的打印結(jié)構(gòu)幾何設計

皮膚和肌腱分別是不規(guī)則致密結(jié)締組織和規(guī)則致密結(jié)締組織。在皮膚組織中，膠原纖維形成高階網(wǎng)絡，構(gòu)成主要的真皮結(jié)構(gòu)，負責多方向的拉力，肌腱在膠原纖維結(jié)構(gòu)中帶有更多的定向模式，在肌肉收縮時傳遞和承受單向的張力。建立定向的細胞結(jié)構(gòu)對結(jié)締組織的體外重塑具有重要意義。本研究將HiNorCol和LoNorCol在同一方向上交替打印，限制LoNorCol在打印方向上的收縮。HiNorCol的較高硬度將通過粘附界面?zhèn)鬟f給含有細胞的LoNorCol。細胞遵循硬度梯度的趨勢，是細胞定向的根本原因。細胞內(nèi)的分子馬達，如肌球蛋白II，通過剛性的肌動蛋白絲束和順應性的跨膜分子離合器，如整合素，將力傳遞給ECM。單一的馬達-離合器引起不同的變形，成為柔軟或堅硬的基質(zhì)，導致牽引力和F-actin的逆向流速的差異，反過來又影響了細胞行為。該結(jié)果表明當一個細胞在前部和后部對基質(zhì)施加相等的力時，不同程度變形了僵硬程度分級的ECM，在軟邊緣比僵硬邊緣變形更多，從而導致細胞中心向基質(zhì)較硬區(qū)域轉(zhuǎn)移。在三維環(huán)境中，基質(zhì)硬度的增加也會增加內(nèi)皮細胞的萌發(fā)和生長。

圖5 打印肌腱結(jié)構(gòu)的特點

研究人員打印了不同的肌腱結(jié)構(gòu)，以揭示肌腱厚度和長絲大小對細胞取向的影響。增加厚度的肌腱結(jié)構(gòu)被稱為加厚的肌腱。用兩根錐形HiNorCol絲來增加硬段比例的肌腱結(jié)構(gòu)被稱為雙HiNorCol絲。在培養(yǎng)7天后，所有組別都顯示出明顯的細胞定向。統(tǒng)計學結(jié)果也顯示所有組別都有較高的細胞定向，三組之間沒有明顯的差異。根據(jù)上文的假設，增加硬塊的比例不會減少肌腱結(jié)構(gòu)垂直方向上的剛度差異。不同厚度的肌腱顯示出相似的細胞方向，證明Z方向結(jié)構(gòu)的變化對xy平面的影響很小，進一步證明將三維凝膠簡化為二維是可行的。晚期約束的方法對引導細胞取向具有廣泛的適應性。接著還觀察了細胞向HiNorCol遷移的過程。第7天，細胞開始爬到HiNorCol的表面。14天時，NiNorCol被細胞完全覆蓋。

本文開發(fā)了一種新的基于膠原蛋白混合打印系統(tǒng)，具有高打印保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物相容性和細胞活性，適用于結(jié)締組織重建�；�于完整的膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)，NorCol隨著濃度的增加顯示出優(yōu)異的擠出性能和可調(diào)節(jié)的機械強度，使得HiNorCol能夠打印出復雜、精致和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。體內(nèi)植入結(jié)果證實，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對于軟水凝膠在原位保持不流失，加速組織和血管向打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的浸潤至關(guān)重要。結(jié)合LoNorCol，打印了大量的脂肪組織，其中BMSCs分化為脂肪生成細胞。依靠NorCol緊密結(jié)合界面，構(gòu)建了一個由幾何結(jié)構(gòu)引導的、與模量無關(guān)的差異性三維剛度環(huán)境，并實現(xiàn)了細胞定向以重塑肌腱和皮膚組織。本研究設計的NorCol打印系統(tǒng)證明是解決結(jié)締組織建設中分子、細胞和組織層面多尺度力學要求的一種有前途的方法。應該加速純膠原蛋白作為組織工程和再生醫(yī)學重要生物材料的應用，并提高研究人員對組織打印中細胞機械微環(huán)境的關(guān)注。

文章來源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acc760