3D打印表面活化鎂離子的多孔聚醚醚酮支架

來源：EngineeringForLife

由于天然骨源的短缺，陶瓷、金屬、聚合物和其他人工骨移植材料都在臨床上得到廣泛應(yīng)用。聚醚醚酮憑借其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、較高結(jié)構(gòu)強度且符合骨骼力學(xué)性能等特點，成為骨科植入物的優(yōu)秀材料，但其具有加工困難，高生物惰性等缺點，限制了該材料的設(shè)計與應(yīng)用。如何提高聚醚醚酮植入材料生物安全性、生物相容性、成骨效應(yīng)和其他生物活性是進一步擴展該材料應(yīng)用的重要突破點。

近期，第四軍醫(yī)大學(xué)的郭征、李小康聯(lián)合北京大學(xué)的鄭玉鋒通過3D打印技術(shù)，在鎂金屬表面構(gòu)建了多孔的聚醚醚酮（PEEK）支架，并通過體內(nèi)外實驗共同驗證了該材料的促血管生成和成骨能力。相關(guān)論文“Magnesium surface-activated 3D printed porous PEEK scaffolds for in vivo osseointegration by promoting angiogenesis and osteogenesis”發(fā)表在Bioactive Materials雜志上。

1. 文章總體思路
通過熔融成型沉積技術(shù)制備了3D打印多孔PEEK植入物，對其表面沉積聚多巴胺（PDA）涂層，并利用PDA螯合具有生物活性的鎂離子。作者設(shè)計了三個實驗組：純PEEK支架（PP）、PDA表面修飾PEEK支架（PPD）、PDA-Mg2+表面修飾PEEK支架（PPDM），并在各實驗中進行對比。通過MC3T3-E1和HUVECs評估多孔PEEK支架的生物毒性、成骨和促血管生成能力。通過將支架植入兔的股骨髁，評估材料對體內(nèi)骨缺損修復(fù)過程中的骨整合能力和生物活性（圖1）。

圖1 表面活化鎂離子多孔 PEEK 支架的促血管生成和成骨作用

2. 多孔PEEK支架的3D打印技術(shù)研究
作者對3D打印得到的支架材料進行了孔隙率、孔徑、孔隙聯(lián)通性、應(yīng)力應(yīng)變、壓縮模量等力學(xué)測試，證明其力學(xué)性能與松質(zhì)骨相似（圖2）。接著通過掃描電鏡、原子力顯微鏡和水接觸角測試，發(fā)現(xiàn)各組支架表面形態(tài)沒有顯著差異，且PDA改性后支架親水性明顯提升。Mg2+釋放實驗證明該支架可在兩周內(nèi)持續(xù)釋放生物活性金屬離子。

圖2 多孔PEEK支架的表征和表面分析

3. 多孔PKKE支架的生物安全性和生物活性研究
其次，進行了材料的生物安全性和細胞黏附實驗（圖3-5）。通過對MC3T3-E1和HUVECs進行CCK-8細胞增殖實驗以及流式細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，PDA及PDA-Mg2+改性后支架可促進細胞增殖，且各組凋亡水平無明顯差異，證明該材料無生物毒性。細胞黏附實驗中，通過電鏡、纖維狀肌動蛋白和黏著斑蛋白的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1和HUVECs細胞在改性后表面形態(tài)與未改性材料相比，鋪展面積及黏附相關(guān)蛋白表達含量增加。該組實驗證明Mg2+和PDA表面修飾不會抑制細胞增殖或增加細胞凋亡率，并能夠提高細胞在PEEK材料表面的粘附性，Mg2+可促進MC3T3-E1細胞和HUVECs的增殖，增加MC3T3-E1和HUVECs中vinculin蛋白的表達。

圖3 與各多孔PEEK支架共培養(yǎng)細胞的增殖和凋亡情況

圖4 多孔PEEK支架表面細胞的粘附情況

圖5 通過間接接觸與支架共培養(yǎng)的 HUVECs 和 MC3T3-E1 細胞的粘附情況

4. 多孔PEEK支架的體外成骨效果研究
再次，進行了支架的MC3T3-E1成骨分化實驗（圖6）。首先在轉(zhuǎn)錄水平中，直接接觸共培養(yǎng)后PPDM和PPD組Runx2、Col1和Alp基因的表達顯著上調(diào)，而間接接觸共培養(yǎng)PPDM組中的Runx2、Col1、Alp和Opn基因與其他兩組相比上調(diào)。其次灰度分析表明，各培養(yǎng)狀態(tài)下PPDM中COL1、OPN、Osterix和RUNX2的相對蛋白表達水平均高于其余兩組。最后，在堿性磷酸酶和茜素紅染色中發(fā)現(xiàn)PPDM組中ALP表達與礦化結(jié)節(jié)含量均高于其余兩組。自此，作者從成骨細胞在骨形成中的三個主要階段（成骨細胞的黏附和增殖、成骨分化和細胞外基質(zhì)礦化）多角度證明了該材料具有促進細胞成骨分化和成骨細胞礦化的作用。

圖6 不同支架對MC3T3-E1細胞成骨分化和礦化的影響

5. 改性PEEK支架的體外促血管生成效果研究
然后進行了HUVECs的遷移和血管生成實驗（圖7）。細胞劃痕實驗及血管形成實驗證明PPDM組與其余樣品相比具有促進細胞遷移和血管生成的功能。蛋白水平實驗中，對血管標記CD31和EMCN進行Western blotting及免疫熒光染色實驗，發(fā)現(xiàn)PPDM相關(guān)蛋白表達含量顯著高于其余樣品。證明PPDM有助于血管生成。

圖7 不同支架對 HUVECs 遷移和血管生成的影響

6. 改性PEEK支架的體內(nèi)促血管生成研究
最后驗證了PPDM支架在動物實驗中的成骨和促血管生成的作用（圖8）。從血管生成角度來講，micro-CT顯示PPDM支架內(nèi)部血管更為成熟和連續(xù)，且PPDM組BVV/TV、血管直徑和血管密度都高于其余樣品。在硬組織切片中血管密度和血管直徑測量中，也觀察到類似情況，但植入8周后PPDM與PPD組血管密度差異不顯著。

圖8 多孔PEEK支架中的體內(nèi)血管向內(nèi)生長情況

7. 改性PEEK支架的體內(nèi)骨生成研究
從體內(nèi)骨整合實驗角度分析（圖9），多孔PEEK支架內(nèi)骨向內(nèi)生長的3D重建結(jié)果顯示，植入早期（4周）PPDM組骨體積分數(shù)顯著高于其余各組，12周后PPD與PPDM顯著高于PP組；骨小梁厚度雖然在植入早期三組無明顯差別，但12周后PPDM組顯著高于其余各組。硬組織切片中顯示在所有時間點，PPD組和PPDM組的骨組織與植入物接觸始終高于PP組。結(jié)合PPDM組支架中的Mg2+釋放曲線和體外促血管生成作用可以得出結(jié)論，PPDM組支架能夠通過在植入后早期釋放鎂離子來促進多孔PEEK支架內(nèi)的血管生長。

圖9 各組多孔PEEK支架的體內(nèi)骨整合情況

綜上，作者證明3D打印多孔PEEK結(jié)構(gòu)并在其表面構(gòu)建PDA-Mg2+生物活性涂層是一種提高生物惰性材料生物相容性的簡便方法。含鎂生物活性涂層改性的多孔聚醚醚酮支架在體外表現(xiàn)出優(yōu)異的生物學(xué)功能，如促進細胞增殖和粘附、成骨分化和血管形成。在體內(nèi)實驗中，PDA涂層顯著改善了多孔PEEK支架的界面骨結(jié)合能力，而鎂離子通過促進早期血管向內(nèi)生長而增強了多孔PEEK支架內(nèi)的骨向內(nèi)生長能力（圖10）。該方法為PEEK材料的臨床應(yīng)用提供了新的方法。

圖10 鎂表面活化的 3D 打印多孔PEEK支架促進血管生成和成骨的機制

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.05.011