電流體直寫載細胞纖維技術(shù)，直接將負載活細胞打印在定向的微尺度纖維中

來源： EngineeringForLife  

骨骼肌在人體的運動和其他動態(tài)活動中起著至關(guān)重要的作用。為了治療關(guān)鍵的容積性肌肉缺損，現(xiàn)有研究使用自體肌肉組織植入物和手術(shù)移除壞死或受損肌肉組織以增強愈合潛力。然而，由于骨骼肌在生理學(xué)上具有一種肌肉纖維束和血管平行排列的結(jié)構(gòu)，由于肌纖維結(jié)構(gòu)組織和相關(guān)血管形成的可控性有限，導(dǎo)致再生效率低，傳統(tǒng)治療往往無效。

為此，來自Sungkyunkwan University的GeunHyung Kim課題組提出一種電流體直寫載細胞纖維技術(shù)，可以直接將負載的活細胞打印在定向的微尺度纖維中，誘導(dǎo)成肌細胞沿打印方向生長，相關(guān)論文：Electrohydrodynamic-direct-printed cell-laden microfibrous structure using alginate-based bioink for effective myotube formation發(fā)表于Carbohydrate Polymers。

本研究展示了一種基于海藻酸鹽的生物墨水和新的生物制造方法，以獲得具有機械穩(wěn)定性和可定向的微纖維狀載細胞復(fù)合結(jié)構(gòu)，可有效地誘導(dǎo)骨骼肌組織工程，用于芯片肌肉或恢復(fù)體積肌肉缺損的結(jié)構(gòu)。

首先研究人員設(shè)計了一種帶輔助電極的噴嘴，相比單一針尖具有更均勻分布的電場。打印材料采用由C2C12載于成肌細胞的海藻酸鹽/PEO/纖維蛋白生物墨水組成，在合適的電直寫打印條件下噴射載細胞水凝膠并沉積在接地板上，組成設(shè)計的載細胞微纖維結(jié)構(gòu)，如圖1。

圖1 A）噴嘴電場模擬；B）載細胞電直寫凝膠纖維過程

為了順利進行電直寫打印，研究人員對不同組分的生物墨水進行了評估，并最終確定合適的組分配比，纖維狀態(tài)穩(wěn)定并且直徑在20μm以內(nèi)，如圖2。

圖2 混合不同纖維蛋白組分的生物墨水的各項性能指標

研究人員進一步探索適合的打印參數(shù)，包括施加的電場、噴嘴距離、打印速度，各項參數(shù)的影響結(jié)果如圖3。最終選擇電場強度為0.15kV/mm，噴嘴距離45mm，打印速度40mm/s的參數(shù)來制備載細胞微纖維支架。

圖3 各類參數(shù)下的電直寫效果

為對比電直寫載細胞纖維與傳統(tǒng)的細胞靜電紡絲，研究人員測試了生物墨水在不同電場強度下的細胞活力，如圖4。根據(jù)實驗結(jié)果，0.15 kV/mm的電場可以使細胞保持較高存活率，并且纖維成型較好，因此選擇該參數(shù)制備單軸排列的載細胞微纖維結(jié)構(gòu)。對比傳統(tǒng)細胞靜電紡絲，電直寫能更好地在指定部位沉積，減少損耗，并且由于纖維沉積密集，電直寫纖維的細胞數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)細胞靜電紡絲。另外，在細胞活力、細胞增殖率上，電直寫纖維都要優(yōu)于細胞靜電紡絲，力學(xué)性能也更接近天然肌肉特性。

圖4 電直寫細胞纖維與傳統(tǒng)細胞靜電紡絲對比。A）細胞存活率；B)掃描圖像；C)纖維直徑；D)細胞數(shù)量；E)細胞增殖率；F)力學(xué)性能

研究人員進一步對比了傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細胞靜電紡絲、電直寫載細胞纖維在體外的細胞表征，結(jié)果如圖5。擠出式生物3D打印纖維上肌球蛋白重鏈（MHC）的形態(tài)是隨機的；而傳統(tǒng)細胞靜電紡絲和電直寫載細胞纖維則由于超細纖維形態(tài)而呈現(xiàn)出定向排列。但是排列的細胞只覆蓋在傳統(tǒng)靜電紡絲組的表面，而細胞在電直寫纖維上以束狀相互連接。這種有效的細胞排列可以同時具有高細胞密和適當(dāng)?shù)臋C械性能，并具有定向性能。其他的定量結(jié)果也表明電直寫載細胞纖維有利于成肌細胞的排列和分化，促進了肌源性分化和成熟肌管。因此，研究人員使用電直寫載細胞纖維進行C2C12成肌細胞與HUVECs的共培養(yǎng)。

圖5 傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細胞靜電紡絲、電直寫載細胞纖維在體外的生物性能表征

接下來研究人員對HUVECs負載結(jié)構(gòu)對共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)致肌活性的影響進行了研究，圖6。結(jié)果證實C2C12與HUVECs共培養(yǎng)有利于肌肉組織再生。在使用C2C12和HUVECs制備復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)之前，測試了HUVECs在電直寫工藝下的細胞活力和纖維形態(tài)(0.09-0.21 kV/mm)，根據(jù)結(jié)果，最終選擇了0.15 kV/mm的參數(shù)來制作載HUVECs的纖維結(jié)構(gòu)。

圖6 (A) C2C12和HUVEC共培養(yǎng)染色圖像。(B) 共培養(yǎng)細胞的相對基因表達。(C) 0.09-0.21 kV/mm電場制備的HUVEC負載纖維原位活/死圖像

如圖7(a)所示，制備了負載HUVECs的電直寫載細胞纖維(HUVEC-EDF)，如圖7（A），這表明該制備工藝和微環(huán)境可以支持HUVECs生長。然后制備了負載C2C12的纖維(C2C12- EDF)和負載C2C12/ HUVECs的復(fù)合纖維(CH-EDF)，并比較了體外細胞活性，圖7（C）。根據(jù)相關(guān)細胞因子的表達檢測結(jié)果分析，由于生物物理和生化信號的協(xié)同作用，負載C2C12/ HUVECs的微纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)能夠高效地再生肌肉組織。

圖7 負載HUVECs、負載C2C12、復(fù)合纖維成肌效果對比

最后，為了評估肌肉缺損的再生能力，如圖8，采用電直寫載細胞纖維工藝，用脂肪干細胞(ASCs)和HUVECs構(gòu)建肌肉結(jié)構(gòu)（AH-FS）。使用GelMA和3D打印工藝作為對照，制造載ASC的常規(guī)結(jié)構(gòu)（A-CS）。經(jīng)過對比，AH-FS組顯著誘導(dǎo)肌再生，這些在體內(nèi)的結(jié)果代表了細胞負載纖維結(jié)構(gòu)治療容積性肌肉損失（VML）的潛力。

圖8 脛骨前肌(TA)缺損及再生結(jié)構(gòu)植入示意與對比結(jié)果

總結(jié)，該研究提出了一種新的電直寫載細胞水凝膠纖維的工藝，能夠制造高度定向的含細胞微纖維。與細胞靜電紡絲工藝不同，該方法提供了具有合理力學(xué)性能和較高細胞密度的微纖維結(jié)構(gòu)，成功實現(xiàn)了顯著的細胞生長和肌源性分化。該研究揭示了一種新的電流體動力打印的可能性，制造具有定向效果的細胞負載微纖維結(jié)構(gòu)，用于肌肉組織再生。

參考文獻
Miji Yeo, GeunHyung Kim, Electrohydrodynamic-direct-printed cell-laden microfibrous structure using alginate-based bioink for effective myotube formation, Carbohydrate Polymers
https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.118444