誘導(dǎo)自然骨生成，用于3D打印的促成骨互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水

來(lái)源：EngineeringForLife

生物打印是一種新興的增材制造方法，用于制備再生醫(yī)學(xué)的3D結(jié)構(gòu)。然而，開(kāi)發(fā)具有高打印性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物降解性和生物活性特性的細(xì)胞相容生物墨水仍然是將3D生物打印技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床前和臨床模型的主要挑戰(zhàn)。

來(lái)自Texas A&M University的Akhilesh K. Gaharwar團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種納米工程離子-共價(jià)糾纏(NICE)的互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水配方，用于3D骨生物打印。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NICE生物墨水在制造患者特異性、可植入的3D支架用于修復(fù)顱頜面骨缺損的能力。該生物墨水有望推動(dòng)3D打印再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。相關(guān)論文“NanoengineeredOsteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue”發(fā)表在ACS Applied Materials ＆ Interfaces雜志上。

NICE生物墨水有三個(gè)主要成分：共價(jià)交聯(lián)的甲基丙烯酰明膠(GelMA)，離子交聯(lián)的卡帕卡拉膠(kCA)，和靜電帶電的納米硅酸鹽(nSi)。GelMA提供了一種類(lèi)似細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的環(huán)境。kCA是從海提取的多糖，可以通藻中過(guò)鉀離子進(jìn)行離子交聯(lián)(圖1A)。GelMA和kCA的結(jié)合形成了離子共價(jià)糾纏網(wǎng)絡(luò)(圖1A)。這種結(jié)合極大地提高了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和韌性。

為了評(píng)估生物墨水的可打印性，研究者選擇了一個(gè)能夠打印的高長(zhǎng)寬比結(jié)構(gòu)，從而找到一系列可打印的成分(圖1B-C)。結(jié)果表明，如果沒(méi)有足夠的kCA,GelMA和nSi打印效果不好，因?yàn)樗鼈冊(cè)跓崮�膠前會(huì)流動(dòng)(圖1D)。kCA提供臨界粘度和屈服應(yīng)力，在擠壓層冷卻并通過(guò)熱凝膠固化時(shí)，將其固定在適當(dāng)位置。

圖1 NICE生物墨水設(shè)計(jì)和打印性能評(píng)估

接下來(lái)研究者設(shè)計(jì)了峰保持流變性試驗(yàn)來(lái)模擬3D打印過(guò)程中的生物墨水環(huán)境。交聯(lián)的3D打印水凝膠能夠維持剪切、彎曲和拉伸等機(jī)械變形，沒(méi)有明顯的永久變形，并能迅速恢復(fù)其原始形狀(圖2B)。將支架交聯(lián)并植入下頜骨的熱塑性模型中發(fā)現(xiàn)，NICE生物墨水能夠迅速將表面粘在一起，抵抗剪切和分層力（圖2 D）。根據(jù)這些結(jié)果，最終選擇7.5% GelMA、2%nSi和1%kCA作為優(yōu)化的生物墨水進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。

圖2 NICE生物墨水的流變性和3D打印結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能

3D生物打印支架最初是透明的，但培養(yǎng)60天后，支架變得不透明(圖3A)。力學(xué)測(cè)試顯示，3D打印支架在PBS和培養(yǎng)基的作用下，其壓縮模量和韌性在14天內(nèi)保持不變，但在第21天出現(xiàn)顯著損失(圖3B)。支架在60天內(nèi)保持了結(jié)構(gòu)的完整性，并保留了超過(guò)80%的初始質(zhì)量(圖3C)。掃描電鏡成像顯示，從第14天開(kāi)始微觀結(jié)構(gòu)密度增加(圖3D)。這表明，發(fā)生了大量的細(xì)胞介導(dǎo)的重塑，其廣度足以將3D打印支架的宏觀結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起。

圖3 NICE支架支持細(xì)胞誘導(dǎo)的基質(zhì)重塑

然后研究者使用組織學(xué)方法評(píng)估了幾個(gè)月以來(lái)由hMSCs對(duì)NICE生物打印支架的重塑，顯示軟骨形成的軟骨內(nèi)骨化樣重塑過(guò)程，隨后礦化，類(lèi)似于自然骨形成。結(jié)果表明，NICE生物墨水即使在沒(méi)有成骨誘導(dǎo)因子的情況下也能誘導(dǎo)成骨分化和組織重塑。此外，在這幾個(gè)月的培養(yǎng)和重塑過(guò)程中，支架保持其整體形狀和完整性，這表明支架的生物降解與細(xì)胞重塑是同步的。（圖 4）

圖4 3D生物打印支架的ECM重塑

研究者用Von Kossa和茜素紅染色來(lái)區(qū)分類(lèi)骨質(zhì)和實(shí)際鈣化骨(圖5A)。正如預(yù)期的那樣，VonKossa和茜素紅在早期的時(shí)間點(diǎn)上都沒(méi)有顯著的鈣或磷酸鹽存在，但幾周后，可以看到顯著的鈣和磷酸鹽沉積。使用鈣-甲酚酞絡(luò)合酮測(cè)定法定量檢測(cè)鈣含量并且通過(guò)EDS顯示鈣含量的變化(圖5B-D)。結(jié)果顯示，支架內(nèi)最初并沒(méi)有鈣的存在，培養(yǎng)60天后，由于hMSCs成骨分化，鈣和磷酸鹽含量增加。

圖5 3D生物打印支架的礦化基質(zhì)

為了證實(shí)軟骨內(nèi)成骨，研究者使用RNA全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)表征hMSCs中的基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)暴露于nSi的hMSCs的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，可以確定軟骨內(nèi)骨形成的基因表達(dá)增加。值得注意的是，BMP和TGF信號(hào)同時(shí)存在，它們的SMAD信號(hào)通路表達(dá)增加，表明NICE能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨內(nèi)分化。（圖 6）

圖6 nSi對(duì)hMSC基因表達(dá)的影響

綜上所述，這種NICE生物墨水具有3D生物打印骨組織的多種理想特性，包括高打印性能、酶降解性和骨誘導(dǎo)性。這項(xiàng)研究的最終目標(biāo)是為患者打印特定的骨支架來(lái)精確匹配他們的損傷。這種技術(shù)將作為一種可定制的、易于操作的自體骨移植替代方案，為外科醫(yī)生提供更多的骨手術(shù)選擇。

參考閱讀：

David Chimene, Logan Miller, Lauren M.Cross, Manish K. Jaiswal, Irtisha Singh, and Akhilesh K. Gaharwar.Nanoengineered Osteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue. ACSApplied Materials & Interfaces.

https://doi.org/10.1021/acsami.9b19037