頂刊綜述：再談“生物3D打印-從形似到神似”

作者： 高博士
來源：EngineeringForLife

相比于傳統(tǒng)組織工程方法，新興的生物3D打印技術(shù)可對載細胞的生物材料進行精確控制，這為構(gòu)建仿生結(jié)構(gòu)和組織再生提供了新思路。自生物3D打印概念提出以后，關(guān)于生物墨水、打印方法及打印裝備的研究層出不窮，這也極大地促進了生物3D打印技術(shù)的蓬勃發(fā)展。然而，生物3D打印發(fā)展到今天，很多學者開始思考：體外構(gòu)建真正具有生物功能的組織結(jié)構(gòu)，到底需要什么樣的生物墨水和打印方法？還有哪些因素需要考慮？因此，為了實現(xiàn)生物3D打印的功能化突破和應用，該領(lǐng)域的研究導向逐漸從關(guān)注結(jié)構(gòu)成形（“形似”）過渡到注重生物功能的形成（“神似”）。

EFL團隊在18年發(fā)表的綜述論文上，特別闡述了“生物3D打印-從形似到神似”的觀點。近兩年，隨著生物3D打印的發(fā)展，涌現(xiàn)了很多以生物功能為目標的研究工作。為此，很多團隊系統(tǒng)總結(jié)了生物3D打印技術(shù)的最新進展，例如，2019年4月，哈佛醫(yī)學院Yu Zhang教授在Small上發(fā)表的“3D Bioprinting: from Benches to Translational Applications”綜述文章，以及2020年2月，烏得勒支大學Jos Malda教授在Advanced Materials上發(fā)表的“From Shape to Function：The Next Step in Bioprinting”綜述文章。在此，筆者期望通過這兩篇綜述論文，結(jié)合EFL團隊的思考，再次梳理下生物3D打印從“形似”到“神似”的研究進展。

內(nèi)容概覽

一、“形似”研究進展
生物墨水是成功打印組織和器官結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵和基礎。一般來說，生物墨水應該兼具可打印性和生物相容性�？纱蛴⌒灾干�物墨水適合制造具有高結(jié)構(gòu)完整性和保真度的3D結(jié)構(gòu)，而生物相容性表示生物墨水對細胞友好，并支持細胞粘附、增殖和鋪展。圍繞這個目標，生物3D打印研究初期，主要是選用生物水凝膠作為打印墨水，包括天然水凝膠和合成水凝膠。接著將通用增材制造原理應用于載細胞的水凝膠打印，開發(fā)出了多種生物3D打印方法，包括：光固化生物3D打印、噴墨生物3D打印、激光直寫生物3D打印、擠出式生物3D打印機以及電紡絲生物3D打�。ㄈ鐖D1），這些方法都有其獨特優(yōu)勢、局限性以及適用范圍，這里不再贅述。

圖1 典型的生物3D打印技術(shù)：（A）光固化生物3D打��；（B）噴墨生物3D打��；（C）激光直寫生物3D打印；（D）擠出式生物3D打印機；（E）電紡絲生物3D打印

生物3D打印的“形似”研究，主要圍繞以構(gòu)建高保真度結(jié)構(gòu)為目標的生物墨水及打印策略設計。鑒于此，以材料適用范圍最廣的擠出式生物3D打印方法為例，重點介紹基于此目標的墨水及打印方法設計策略。具體可分為聚焦墨水設計的策略：新的化學交聯(lián)思路、調(diào)節(jié)流變性能；以及聚焦重新設計墨水環(huán)境的打印策略；同軸/微流控打印、支撐浴懸浮打印。

1.新的化學交聯(lián)思路：精確控制墨水的交聯(lián)過程對于獲得具有高的形狀保真度至關(guān)重要。一種策略是通過采用階梯生長反應來控制交聯(lián)的化學過程，例如基于硫醇-烯階梯生長反應機理，對明膠進行的烯丙基改性得到GelAGE。相比于�；�改性得到的GelMA，GelAGE表現(xiàn)出更快的反應速率、更均勻的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)（圖2A）。另一種策略是通過控制交聯(lián)時間來保證形狀保真度，典型的例子是原位光交聯(lián)策略，將墨水吸入透光玻璃毛細管在擠出前進行光交聯(lián)，擠出后可保持較好的微絲形態(tài)（圖2B）。此外，使用可見光引發(fā)劑（如LAP、Ru/SPS）代替紫外光引發(fā)劑（2959）也是一種既可提高交聯(lián)速度有能改善細胞活性的策略（圖2C）。

圖2 新的化學交聯(lián)思路：（A）階梯生長反應得到的GelAGE與普通化學交聯(lián)的GelMA對比；（B）原位光交聯(lián)策略；（C）紫外光改為可見光引發(fā)策略

2.調(diào)節(jié)流變性能：調(diào)節(jié)墨水流變性能是一種常用的實現(xiàn)高形狀保真度的策略。早期的方法是通過增加聚合物濃度或者添加流變改進劑實現(xiàn)。近期已開發(fā)出諸如逐步交聯(lián)、添加納米材料、以及構(gòu)建膠體墨水等策略。逐步交聯(lián)策略指兩種或兩種以上不同交聯(lián)方式的逐步交聯(lián)過程，執(zhí)行第一交聯(lián)步驟來調(diào)節(jié)墨水的流變特性，然后引入第二交聯(lián)步驟以確保結(jié)構(gòu)的長期穩(wěn)定性（圖3A）。另一種策略是在墨水中添加納米硅酸鹽，提高剪切變稀性能，同時誘導自我修復，提高形狀保真度（圖3B）。此外，近期出現(xiàn)了一種新的膠體墨水（將水凝膠加工成穩(wěn)定的、交聯(lián)的微凝膠混合體系），凝膠顆粒之間不斷增加的物理相互作用導致整體流變特性從粘度主導轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥灾鲗У恼硰椥孕袨椋▓D3C）。

圖3 調(diào)節(jié)流變性能：（A）逐步交聯(lián)策略；（B）納米材料輔助打印策略；（C）構(gòu)建膠體墨水策略

3.同軸/微流控打印：同軸擠出通過使用同軸組裝的噴嘴，可以同時同心沉積不同材料，從而形成雙層或多層纖維(圖4A、B)。與普通的擠出方式相比，同軸擠出中的交聯(lián)劑和墨水溶液的空間分離允許使用較低粘度的墨水，同時保持高的形狀保真度。同軸系統(tǒng)非常適合于海藻酸鹽及其混合物的打印（氯化鈣作為交聯(lián)劑）。此外，通過將海藻酸鹽與鈣溶液共打印來產(chǎn)生可灌注的血管結(jié)構(gòu)，同軸擠出為大組織的營養(yǎng)供給提供了有前途的解決方案(圖4C)。微流控系統(tǒng)可以在微尺度上精確操縱液體行為，可實現(xiàn)不同墨水的快速無縫切換(500ms)，這使得該方法成為通過改變不同材料的沉積時序來構(gòu)建漸變結(jié)構(gòu)的有效工具(圖4D)。

圖4 同軸/微流控打�。海ˋ、B）同軸打印策略；（C）EFL團隊提出的同軸打印構(gòu)建血管網(wǎng)絡；（D）微流控輔助打印梯度結(jié)構(gòu)

4.支撐浴懸浮打�。夯�于擠出打印將生物墨水在支撐浴材料內(nèi)沉積，利用支撐材料提供的中性浮力和空間約束，生物墨水可以很好保持形狀。通過消除重力和表面張力，能夠打印其他擠出方式不可能處理的低粘度墨水（圖5）。除了提高分辨率外，該方法還可以使打印的組織在潮濕的環(huán)境中保持長期穩(wěn)定性，減小制造過程中細胞損傷。支撐浴材料的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于要具有可控流變特性的非牛頓流體行為（當噴頭運動對支撐浴產(chǎn)生剪應力時，它必須局部液化；當剪應力消失后，它的粘度需要增加，以固定住墨水并支撐復雜結(jié)構(gòu)的制造）。此外，支撐浴材料還應該是細胞相容的，易于去除，以及不能干擾墨水的交聯(lián)。

圖5 支撐浴懸浮打印

二、“神似”研究進展
越來越多的生物打印策略為構(gòu)建復雜結(jié)構(gòu)提供方案，然而，解剖結(jié)構(gòu)的高保真生物打印方法并不能確保獲得天然組織的功能。當細胞和材料的空間沉積得到很好的控制以后，生物結(jié)構(gòu)將需要經(jīng)歷成熟、形態(tài)形成等發(fā)育過程，這已被定義為生物打印過程的一個組成部分。然而，到目前為止，證明生物打印在組織水平上對生物功能進化具有優(yōu)勢的研究例子仍然有限。其中一個原因是，專注于材料和工藝開發(fā)的研究經(jīng)常停留在概念驗證，但沒有明確說明打印在最終功能應用方面的優(yōu)勢。

雖然構(gòu)建全功能的組織所需的確切相似度尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明，根據(jù)細胞和材料組成以及多個成分之間的相互作用來控制打印結(jié)構(gòu)的形狀對于縮短工程組織和天然組織之間的差距至關(guān)重要。因此，生物3D打印的“神似”研究，主要圍繞以誘導細胞和組織功能為目標的生物墨水及打印策略設計，包括功能性生物墨水開發(fā)、細胞來源匹配、以及新的打印策略設計。此外，還提出了生物打印與細胞自組裝協(xié)同策略。

1.功能性生物墨水開發(fā)：與簡單添加生物活性化合物不同，一種更有效的方法是使用天然模板作為生物墨水。通過脫細胞和溶解來自脂肪、軟骨和心肌組織的ECM，已經(jīng)獲得了可打印的、細胞相容的dECM墨水。利用體內(nèi)常駐細胞分泌的細胞外基質(zhì)，可更好構(gòu)建細胞微環(huán)境，促進細胞生存、粘附、擴散、增殖、遷移、分化，以及組織形成和修復。基于dECM墨水，已成功誘導特定組織生長，包括軟骨、心肌、脂肪和肝臟組織（圖6）。此外，生物墨水設計中還需添加多肽、蛋白等細胞所需活性物質(zhì)，可控釋放的活性載體物質(zhì)，以及誘導具有電生理特性組織再生的導電物質(zhì)等。

圖6 基于dECM墨水打印功能性組織結(jié)構(gòu)

2.細胞來源匹配：生物打印通常被定義為“利用3D打印技術(shù)操縱含有活細胞的材料”，因此，生物打印功能化的關(guān)鍵之一在于細胞的選用。生物打印的細胞來源包括：骨髓干細胞（MSCs）、脂肪干細胞（ASCs）、羊膜臍帶干細胞（AFSCs）等專能干細胞，胚胎干細胞（ESCs）、誘導多功能干細胞（IPSCs）等多能干細胞，以及患者自體細胞（圖7A）。根據(jù)所需的組織類型，相應地選擇細胞，并為其提供最佳的微環(huán)境，使其能夠增殖、擴散、分化。研究表明干細胞顯示出構(gòu)建特定功能結(jié)構(gòu)的高潛力，結(jié)合復雜結(jié)構(gòu)、梯度結(jié)構(gòu)、以及復合結(jié)構(gòu)，可實現(xiàn)生物3D打印組織特定功能的重建（圖7B-I）。

圖7 （A）細胞來源類型；（B-I）不同細胞打印應用

3.新的打印策略設計：為了獲得用于臨床應用的仿生組織，不僅需要功能性生物墨水和細胞源，而且需要將這些元素整合到更新的打印策略中，以進一步實現(xiàn)生物打印的功能化。近幾年，出現(xiàn)了以功能實現(xiàn)為目標的新的打印策略，包括高精度打印、定向結(jié)構(gòu)打印、梯度/多材料打印、血管網(wǎng)絡打印、原位打印、4D打印。

1）高精度打印：為了體外構(gòu)建在細胞功能誘導上起關(guān)鍵作用的微/納結(jié)構(gòu)，需要提高生物打印技術(shù)的分辨率（圖8A）。將傳統(tǒng)靜電紡絲與3D打印結(jié)合產(chǎn)生的電紡絲生物3D打印技術(shù)，可以實現(xiàn)300nm纖維的打�。▓D8B-D）。此外，高精度纖維與水凝膠復合，可以產(chǎn)生協(xié)同增強效果，有利于組織再生（圖8E-H）。

圖8 高精度打�。海ˋ）傳統(tǒng)擠出得到的低分辨率結(jié)構(gòu)；（B-D）電紡絲生物3D打�。唬‥-H）電紡纖維/水凝膠協(xié)同增強

2） 異質(zhì)結(jié)構(gòu)打�。涸S多組織的功能歸功于它們的各向異性結(jié)構(gòu)，例如，神經(jīng)網(wǎng)絡中的信號傳遞，肌細胞束的力驅(qū)動，骨骼承受機械負荷的能力，都是由細胞及其細胞外基質(zhì)顯示的分層排列和優(yōu)先方向性驅(qū)動的。因此，通過打印及墨水策略的特殊設計，進行各向異性結(jié)構(gòu)的可控打印，可促進定向組織的功能化（圖9）。

圖9 異質(zhì)結(jié)構(gòu)打印

3）梯度/多材料打印：組織功能與不同類型細胞的持續(xù)相互作用以及組織界面緊密相關(guān)，例如，骨-軟骨界面、韌帶-骨界面。通過自混合打印噴頭設計來調(diào)節(jié)兩種生物墨水的體積比，可獲得具有連續(xù)梯度的組織結(jié)構(gòu)（圖10A）。通過將不同材料墨盒與單噴頭擠出系統(tǒng)或光固化系統(tǒng)集成，可實現(xiàn)不同墨水的快速連續(xù)切換（圖10B、C）。

圖10 梯度/多材料打�。海ˋ）基于混合噴頭打印梯度結(jié)構(gòu)；（B）多材料擠出式打��；（C）多材料光固化打印

4）血管網(wǎng)絡打�。貉�管網(wǎng)絡打印是組織功能化的關(guān)鍵一步，打印策略設計的難點在于如何在生物組織打印過程中引入血管網(wǎng)絡。目前方法主要包括將多材料打印與血管化策略相結(jié)合（圖11A），基于支撐浴懸浮打印犧牲墨水并將支撐浴轉(zhuǎn)變?yōu)?D基質(zhì)（圖11B），以及開發(fā)多隔室的墨盒（圖11C）。

圖11 血管網(wǎng)絡打印：（A）集成多材料和血管化打印策略；（B）支撐浴懸浮打印策略；（C）多隔室墨盒策略

5）原位打�。焊鷤鹘y(tǒng)的打印后再移植的思路不同，原位生物打印提供了一種將組織沉積在需要位置的新思路。原位打印依賴于在缺損中放置可以與周圍內(nèi)源性組織相容并誘導血管新生的組織類似物。目前策略包括集成3D掃描儀的打印系統(tǒng)（圖12A）以及手持式生物打印設備（圖12B），主要用于皮膚、軟骨缺損的修復。

圖12 原位打�。海ˋ）集成3D掃描儀的打印系統(tǒng)；（B）手持式生物打印設備

6）4D打印：自然組織的獨特功能往往是由外界刺激引起的組織構(gòu)象的動態(tài)變化形成的。例如，心臟規(guī)律跳動調(diào)節(jié)全身血液循環(huán)，是由副交感神經(jīng)系統(tǒng)控制，并由電刺激下的心肌收縮驅(qū)動。4D打印是在3D打印的基礎上發(fā)展起來的，打印的結(jié)構(gòu)可在外部刺激下隨時間改變其結(jié)構(gòu)。通常是在墨水中添加具有特殊響應的功能材料實現(xiàn)的（圖13）。

圖13 4D打印

4.生物打印與細胞自組裝協(xié)同策略：事實上，在生物制造技術(shù)興起之前，融合發(fā)育生物學和工程學的發(fā)育工程技術(shù)（細胞自組裝）已成為推進組織工程發(fā)展的新模式。其主要特征是從與體內(nèi)連續(xù)發(fā)育階段相對應的順序子過程中進行體外過程設計，這些子過程遵循細胞分化和組織生長的漸進協(xié)調(diào)發(fā)展。自組裝的多細胞模塊形成是該技術(shù)的關(guān)鍵一步，但是如何能夠以受控的方式將中間模塊組裝成更大的組織單元是個很大的挑戰(zhàn)。因此，生物打印和細胞自組裝技術(shù)協(xié)同開發(fā)，可以極大地促進工程組織的功能化。這可以通過兩種不同的方式實現(xiàn)(圖14)。其一，生物打印可以施加特定的結(jié)構(gòu)設計，允許祖細胞被打印成類器官結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生誘導進一步自組織的條件，形成更大功能組織結(jié)構(gòu)的潛力。其二，祖細胞懸浮液可以自組織成亞毫米到毫米級的結(jié)構(gòu)，然后，這些只包含中等復雜性的結(jié)構(gòu)可以被生物打印成更復雜的組織和器官，其幾何形狀和圖案可用于指導功能組織的形成。

圖14 生物打印和細胞自組裝技術(shù)協(xié)同策略

目前通過生物墨水、打印技術(shù)、以及多種組織工程方式融合等解決復雜問題的工程方法，在生物打印功能化上取得了一些進展。但是，復雜的工程系統(tǒng)（例如汽車、飛機或計算機）是可知的，可以通過定義的規(guī)則完全理解，并通過衍生的方法來處理它們，然后可以完全預測它們的行為。相反，由于存在太多的未知變量相互作用，復雜的生物系統(tǒng)不是完全可知的。我們不能只通過用于復雜工程系統(tǒng)的策略來處理它們，但可以通過觀察和研究生物系統(tǒng)如何發(fā)展和進化的，來獲得一些理解。此外，隨著生物醫(yī)學研究的不斷進步，與復雜生物系統(tǒng)相關(guān)的新的機制也在不斷被發(fā)現(xiàn)。未來，對組織/器官再生過程中潛在的自組織機制的認識和應用，將是功能性生物組織成功打印的關(guān)鍵。

參考文獻：
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