《ACS AMI》：使用低粘度生物墨水打印異質(zhì)3D生物結(jié)構(gòu)

來(lái)源： EngineeringForLife

生物打印是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，旨在通過(guò)特定細(xì)胞和生物材料的受控空間沉積來(lái)重建復(fù)雜的生理微環(huán)境用于體內(nèi)再生和體外建模目的。可以通過(guò)合成水凝膠來(lái)制造微型結(jié)構(gòu)增強(qiáng)的可調(diào)性和先進(jìn)的生物打印技術(shù)，支持在微擠壓生物打印中創(chuàng)建復(fù)雜的設(shè)計(jì)。然而，支持全面細(xì)胞生物活性（包括細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化）的水凝膠是柔軟的且表現(xiàn)出較低的形狀保真度和機(jī)械穩(wěn)定性。

為了應(yīng)對(duì)這一問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了融合生物打印。在此方面，來(lái)自韓國(guó)高等科學(xué)技術(shù)學(xué)院的Je-Kyun Park團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了大量研究，在微結(jié)構(gòu)基底上展示了天然和低粘度水凝膠的高分辨率生物打印。由于其固體基底，該平臺(tái)僅限于創(chuàng)建單層水凝膠。近日，該團(tuán)隊(duì)又引入了一種新的平臺(tái)，能夠制造具有增強(qiáng)分辨率的多層復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)，以充分利用生物打印的多功能性。用于使用稱為3D微網(wǎng)格-生物墨水覆蓋結(jié)構(gòu)和互鎖培養(yǎng)（3D MOSAIC）平臺(tái)的混合生物制造方法來(lái)生物打印天然和細(xì)胞相容性哺乳動(dòng)物水凝膠（圖1）。3D MOSAIC平臺(tái)能夠精確沉積低粘度水凝膠，具有增強(qiáng)的可打印性、分辨率和穩(wěn)定性，同時(shí)保留天然水凝膠的理想特性。

相關(guān)研究成果以“Hybrid Biofabrication of Heterogeneous 3D Constructs Using Low-Viscosity Bioinks”為題于2023年8月24日發(fā)表在《ACS Appl. Mater. Interfaces》上。

圖1 使用3D MOSAIC平臺(tái)制造低粘度水凝膠3D結(jié)構(gòu)

作者使用商用FDM 3D打印機(jī)在微網(wǎng)上打印聚乳酸(PLA)框架，以方便生打印、堆疊和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的處理。對(duì)同一型號(hào)的FDM 3D打印機(jī)進(jìn)行修改并與注射泵集成，以創(chuàng)建內(nèi)部開(kāi)發(fā)的微擠出生物打印機(jī)（圖1A）。微網(wǎng)格的平紋編織，水平和垂直的金屬絲交替地在彼此之上和之下通過(guò)，以毛細(xì)管釘扎效應(yīng)支撐打印的水凝膠，并實(shí)現(xiàn)高分辨率生物打�。▓D1B）。微網(wǎng)格僅占據(jù)一小部分打印結(jié)構(gòu)（圖1C）。然后，可以使用設(shè)計(jì)用于安裝在6孔板中的對(duì)準(zhǔn)器來(lái)對(duì)準(zhǔn)和堆疊PLA框架的微網(wǎng)格生物墨水層，以形成3D MOSAIC單元（圖1D、E）�；�于該平臺(tái)，可以使用天然低粘度水凝膠創(chuàng)建復(fù)雜的微型組織生物結(jié)構(gòu)，包括懸垂結(jié)構(gòu)和中空結(jié)構(gòu)（圖1F）。

1. 油墨類型、微網(wǎng)格和印刷參數(shù)對(duì)印刷結(jié)構(gòu)的影響

在微觀尺度上，與宏觀系統(tǒng)相比，表面與體積之比要高得多，導(dǎo)致表面力（例如表面張力）超過(guò)體力（例如重力）。接觸角是3D MOSAIC的重要參數(shù)，因?yàn)樗�影響生物墨水在微網(wǎng)格上的擴(kuò)散和粘附。將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)、PDMS與固化劑、纖維蛋白原和明膠以10:1的比例混合的液滴放置在帶有金屬絲的微網(wǎng)上（圖2A、B）。聚合物PDMS和低粘度水凝膠纖維蛋白原和明膠以受控尺寸印刷在微網(wǎng)上（圖2C）。

在本研究中，線對(duì)線研究了距離和打印流量作為打印生物墨水尺寸的主要影響因素（圖2D）。研究了線距在63至508 μm之間的微網(wǎng)格，因?yàn)樵摲秶�適合高分辨率打印，同時(shí)為顯微觀察提供足夠大的開(kāi)放面積百分比。根據(jù)圖2B中纖維蛋白原的微網(wǎng)格尺寸和接觸角計(jì)算在相鄰線之間打印水凝膠線的最大流量(Qmax)。當(dāng)打印在線距為63 μm的微網(wǎng)上時(shí)，纖維蛋白原溢出到相鄰泳道，因?yàn)榇蛴�條件不夠敏感，無(wú)法滿足所需的控制（圖2E）。

由于缺乏支撐低粘度水凝膠的微結(jié)構(gòu)，在培養(yǎng)皿上打印的纖維蛋白原寬度比在微網(wǎng)上打印的纖維蛋白原寬度大（圖2E、F）。纖維蛋白原的寬度由線到線的距離統(tǒng)一，并且可以通過(guò)增加打印流量來(lái)加寬（圖2G）。對(duì)于254 μm的線對(duì)線距離，纖維蛋白原被打印在微網(wǎng)格的單道上，流速低于計(jì)算的Qmax且對(duì)于高于其的流速，纖維蛋白原逐道溢出（圖2G、H）。通過(guò)側(cè)面觀察，還可以在低于Qmax 的打印流速下觀察到打印水凝膠的高度（圖2I）。

因此，基于微網(wǎng)格的生物打印技術(shù)產(chǎn)生了具有高分辨率和可控性的結(jié)構(gòu)。微調(diào)線距和優(yōu)化打印參數(shù)進(jìn)一步促進(jìn)了微網(wǎng)格基底上打印生物墨水的寬度和高度的調(diào)節(jié)，從而能夠制造具有精確尺寸和均勻性的結(jié)構(gòu)。在之后的實(shí)驗(yàn)均使用線距為254 μm的微網(wǎng)格，因?yàn)樵摮叽鐚?duì)于具有適當(dāng)穩(wěn)定性和分辨率的生物打印結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)是實(shí)用的。

圖2 油墨類型、微網(wǎng)格和印刷參數(shù)對(duì)印刷結(jié)構(gòu)的影響

2. 利用低打印性的材料制造復(fù)雜的均質(zhì)和異質(zhì)結(jié)構(gòu)

生物打印可以創(chuàng)建復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，并精確控制空間組織和幾何形狀。使用從圖2獲得的微網(wǎng)格和打印參數(shù)，作者用可打印性較差的天然水凝膠制造了復(fù)雜的均質(zhì)和異質(zhì)結(jié)構(gòu)。使用單一類型的彩色纖維蛋白原將線條和晶格打印在線距為254 μm的微網(wǎng)上，以演示低粘度水凝膠的高分辨率打�。▓D3A、B），還根據(jù)圖2G、H中的表征數(shù)據(jù)調(diào)整打印流量，以獲得雙通道格式的相同設(shè)計(jì)（圖3C、D）。水凝膠輪廓和交叉點(diǎn)的精確分辨率和清晰定義證明了基于微網(wǎng)格的生物打印的先進(jìn)能力，可以使用粘度遠(yuǎn)低于適合微擠出打印的常規(guī)范圍的水凝膠創(chuàng)建分隔的微結(jié)構(gòu)。此外，多種類型的生物墨水可以打印在單層微網(wǎng)格上。通過(guò)在生物打印機(jī)頭上安裝兩個(gè)打印噴嘴，彩色明膠和纖維蛋白原依次打印為線條、叉狀結(jié)構(gòu)、雙螺旋和分支結(jié)構(gòu)（圖3F-I）。

圖3 使用基于微網(wǎng)格的生物打印使用單一和多種生物墨水打印的單層設(shè)計(jì)

3. 3D MOSAIC平臺(tái)打印多層和異構(gòu)3D結(jié)構(gòu)

為了創(chuàng)建更全面和多尺度的仿生結(jié)構(gòu)，細(xì)胞相容性水凝膠內(nèi)的自發(fā)和微觀細(xì)胞組織可以與微網(wǎng)格上的直接微擠壓印刷相結(jié)合。通過(guò)應(yīng)用3D MOSAIC平臺(tái)建立基于微網(wǎng)格的生物打印來(lái)制造異質(zhì)和多層3D結(jié)構(gòu)。三組分結(jié)構(gòu)的腎臟模型被概念化為五層，并使用三種類型的熒光染料分子標(biāo)記纖維蛋白原進(jìn)行打�。▓D4A、B）。打印的纖維蛋白原層在微網(wǎng)上交聯(lián)，具有高形狀保真度和結(jié)構(gòu)完整性（圖4C、D）。各個(gè)層對(duì)齊并堆疊以形成2毫米高的完整3D結(jié)構(gòu)（圖4E）。最終的結(jié)構(gòu)由三種天然低粘度水凝膠組成，具有一般的橢圓形結(jié)構(gòu)，具有部分中空的中部和懸垂的脈管系統(tǒng)和輸尿管突起（圖4F）。通過(guò)提供必要的支撐、穩(wěn)定性和空間控制，微網(wǎng)格促進(jìn)了在所有三個(gè)軸上具有空間自由度的結(jié)構(gòu)的組裝。該結(jié)構(gòu)展示了多學(xué)科3D MOSAIC平臺(tái)在創(chuàng)建復(fù)雜設(shè)計(jì)方面的多功能性和潛力，這些設(shè)計(jì)不受印刷適性下限的限制，并且不會(huì)變形和塌陷。

圖4 使用3D MOSAIC平臺(tái)打印多層和異構(gòu)3D結(jié)構(gòu)

為了評(píng)估制造過(guò)程對(duì)細(xì)胞活力的影響，對(duì)生物墨水混合物后立即在纖維蛋白原中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以及在打印40分鐘后直接從注射器和打印噴嘴獲得的生物墨水進(jìn)行了檢查。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞活力也保持較高水平（圖5B、C）。HUVEC均勻分布在打印的水凝膠內(nèi)，并且在14天的培養(yǎng)期內(nèi)沒(méi)有觀察到打印的纖維蛋白結(jié)構(gòu)明顯變形（圖5B）。因此，在3D MOSAIC平臺(tái)中應(yīng)用低粘度生物墨水不僅可以打印細(xì)胞相容性水凝膠，還可以為生物打印提供更溫和的條件。

圖5 生物打印過(guò)程和細(xì)胞培養(yǎng)期間的細(xì)胞活力

隨后的研究，作者將細(xì)胞水凝膠生物墨水在微網(wǎng)上的可靠印刷擴(kuò)展到制造更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。使用含有HUVEC和肺成纖維細(xì)胞(LF)的纖維蛋白原打印五層倒金字塔。生物墨水被打印成輪廓清晰的正方形，尺寸線性增加，HUVEC分布均勻（圖6A）。這些層分別培養(yǎng)并在培養(yǎng)第7天組裝，組成一個(gè)高度約2毫米、纖維蛋白壁厚500微米的倒置空心金字塔（圖6B、C）。在制造方面，層的堆疊不受限制，因?yàn)槲⒕W(wǎng)格有效地固定了印刷的水凝膠結(jié)構(gòu)。重要的一點(diǎn)，3D MOSAIC在模塊化微網(wǎng)格生物墨水的空間和時(shí)間組裝方面非常靈活。

此外，使用基于微網(wǎng)格的生物打印，還可以打印這種天然的低粘度水凝膠來(lái)制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（圖6D）。共培養(yǎng)第7天，HUVEC形成互連的血管網(wǎng)絡(luò)，CD31的免疫熒光染色表明內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的形成，這對(duì)于血管樣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和維護(hù)至關(guān)重要（圖6E）。分叉網(wǎng)絡(luò)分支的共焦圖像的正交視圖揭示了管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的管腔（圖6F）。借助3D MOSAIC平臺(tái)，通過(guò)實(shí)施具有生物功能的水凝膠，重建了具有高水平的生物和結(jié)構(gòu)仿生學(xué)的生理微環(huán)境。

圖6 生物打印微型結(jié)構(gòu)內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的自組織

4. 多層TME的制造和分析

3D MOSAIC平臺(tái)能夠利用模塊化層構(gòu)建全面的生理微環(huán)境。設(shè)計(jì)并制作了腫瘤微環(huán)境（TME）模型，其中跨多個(gè)組裝層建立了細(xì)胞相互作用。TME模型由三個(gè)環(huán)形層組成，每個(gè)層包含MDA-MB-23乳腺癌細(xì)胞、纖維蛋白以及HUVEC和LF的組合，代表癌癥、細(xì)胞外基質(zhì)和脈管系統(tǒng)成分（圖7A、B）。該設(shè)計(jì)旨在模擬TME內(nèi)癌細(xì)胞與微血管系統(tǒng)之間的主動(dòng)相互作用。將三層對(duì)齊、組裝并培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)1周（圖7C）。培養(yǎng)7天后，在 MDA-MB-231細(xì)胞的單一培養(yǎng)對(duì)照條件下，從其初始層觀察到最小的遷移（圖7D）。

然而，當(dāng)HUVEC和LF存在于頂層時(shí)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出向上遷移，到達(dá)中層。此外，觀察到HUVEC向下移動(dòng)，并且還在中間純纖維蛋白層內(nèi)發(fā)現(xiàn)了HUVEC。頂層的HUVEC在第7天時(shí)形成了內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖7E），如之前在圖6中觀察到的。通過(guò)正交共焦成像證實(shí)了MDA-MB-231細(xì)胞的垂直遷移（圖7F）。隨著時(shí)間的推移，遷移細(xì)胞的數(shù)量增加（圖7G）�？偟膩�(lái)說(shuō)，培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出活躍的遷移、基質(zhì)重塑和增殖，證明了只有使用高細(xì)胞相容性生物墨水時(shí)才有可能實(shí)現(xiàn)的高水平細(xì)胞生物活性。

圖7 多層TME的制造和分析

綜上，多學(xué)科3D MOSAIC平臺(tái)提供了一種有前途的策略，可以使用低打印性的天然水凝膠創(chuàng)建復(fù)雜的異質(zhì)3D結(jié)構(gòu)。微網(wǎng)支撐具有毛細(xì)管釘扎效應(yīng)的低粘度水凝膠，以實(shí)現(xiàn)高分辨率結(jié)構(gòu)的生物打印，隨后將其對(duì)齊和堆疊以形成多層結(jié)構(gòu)。在平臺(tái)中血管生成條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在生物功能水凝膠內(nèi)自組織形成血管網(wǎng)絡(luò)。此外，成功構(gòu)建了結(jié)合癌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)成分和血管元件的TME模型，為研究癌細(xì)胞與其周圍微血管之間復(fù)雜的相互作用提供了有價(jià)值的工具。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1021/acsami.3c05750