《Biofabrication》：控制細(xì)胞排列的生物3D打印可用于肌腱分化

來源： EngineeringForLife

生物3D打印是一種能夠精確、受控地沉積細(xì)胞和人工細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)以創(chuàng)建功能性組織結(jié)構(gòu)的技術(shù)。然而，當(dāng)前的生物打印方法仍然難以獲得機(jī)械穩(wěn)定且獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，例如完全對齊的細(xì)胞。近日，來自韓國成均館大學(xué)生物醫(yī)學(xué)融合研究所的GeunHyung Kim團(tuán)隊(duì)提出了一種新的生物打印方法，可以在細(xì)胞中獲得增強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，而不會(huì)失去生物活性或單軸排列細(xì)胞的地形線索。首先，將含有細(xì)胞的dECM溶液填充到聚乳酸(PLA)模具中，然后在溶液中打印不含細(xì)胞的高濃度dECM生物墨水（作為機(jī)械支撐）（圖1）。通過這個(gè)過程，打印的支柱可以通過拖曳力誘導(dǎo)浴生物墨水中的細(xì)胞對齊，同時(shí)，沒有細(xì)胞的叉指式打印的支柱可以充當(dāng)機(jī)械支撐。

相關(guān)研究論文以“Bioprinted hASC-laden cell constructs with mechanically stable and cell alignment cue for tenogenic differentiation”為題于2023年7月25日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 載有hASC的dECM水凝膠的3D打印過程

為了證明這一過程的可行性，作者使用了人類脂肪干細(xì)胞(hASC)和源自豬肌腱的基質(zhì)dECM生物墨水，該生物墨水適合再生肌腱組織，因?yàn)槎ㄏ蚣‰旒?xì)胞促進(jìn)I型和III型膠原基質(zhì)的形成和一些關(guān)鍵的肌腱蛋白。使用該生物打印系統(tǒng)制造的細(xì)胞構(gòu)建體表現(xiàn)出可控的機(jī)械特性和顯著增強(qiáng)的細(xì)胞活性，包括單軸排列的細(xì)胞形態(tài)和肌腱基因表達(dá)（圖1）。

1. 改進(jìn)的生物打印策略和dECM生物墨水
為了將所提出的生物打印方法應(yīng)用于對齊的典型肌肉骨骼組織（肌腱），作者使用源自豬肌腱dECM作為生物墨水。圖2A顯示了從豬腱中提取t-dECM的過程，還定量測量了天然組織和t-dECM中的DNA含量（圖2B）以及生物活性成分彈性蛋白（圖2C）、膠原蛋白（圖2D）和 GAG（圖2E）。結(jié)果表明t-dECM中的生物活性成分得到了很好的保留。為了觀察t-dECM對肌腱分化的生化作用，使用膠原蛋白作為對照，并使用載有hASC的t-dECM生物墨水。圖2G顯示肌腱特異性分化（Scx和Tnmd）的免疫熒光圖像。圖2H還顯示了肌腱相關(guān)基因的表達(dá)（Scx、Tnmd、Col3a1），表明肌腱分化。由于t-dECM的多種肌腱特異性生化成分，與充滿細(xì)胞的膠原蛋白生物墨水相比，使用tdECM的生物墨水顯然誘導(dǎo)了更高的基因表達(dá)水平。

圖2 tdECM的獲取、特性及其生物墨水誘導(dǎo)肌腱能力

2. 打印因素對具有合理細(xì)胞排列的混合細(xì)胞結(jié)構(gòu)的制造的影響
在所提出的打印過程拖流中，由于打印噴嘴和支柱產(chǎn)生的剪切力，t-dECM分子可以被拉長并沿流動(dòng)方向排列。打印支柱附近的速度梯度導(dǎo)致負(fù)載細(xì)胞平行于流動(dòng)方向排列，從而形成梯度排列的細(xì)胞。因此，可以通過調(diào)整PLA模具中填充的t-dECM生物墨水的粘度、噴嘴移動(dòng)速度和打印支柱之間的距離等參數(shù)來控制細(xì)胞排列（圖3）。結(jié)果表明，優(yōu)化后的打印參數(shù)可以確保細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的排列和機(jī)械性能，所得結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞排列和高初始細(xì)胞活力，表明該過程的安全性。

圖3 打印因素對細(xì)胞排列的影響

3. 具有對齊細(xì)胞和隨機(jī)分布細(xì)胞的充滿細(xì)胞的構(gòu)建體的制造

接著，作者展示了具有兩種不同細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（對齊（AL）和隨機(jī)（RD））的充滿細(xì)胞的構(gòu)建體的制造示意圖，用于研究細(xì)胞對齊的效果hASC 的細(xì)胞活性。圖4A和B顯示AL和RD構(gòu)建體的SEM、第1天的活/死以及第3天的鬼筆環(huán)肽染色圖像，以觀察t-dECM形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活力和F-肌動(dòng)蛋白方向。SEM表明AL結(jié)構(gòu)的原纖維化膠原蛋白與打印方向完全對齊，而在RD中的構(gòu)建體，原纖維化膠原隨機(jī)分布。此外，根據(jù)活/死圖像確定的初始細(xì)胞活力顯示出非常高的值(>90%)，并且兩種結(jié)構(gòu)的值相似（圖4C）。作者還評估了Factin的對齊分?jǐn)?shù)，并且AL-構(gòu)建體在打印方向上表現(xiàn)出比RD-構(gòu)建體更大的F-肌動(dòng)蛋白對齊，這表明在AL-構(gòu)建體上培養(yǎng)的細(xì)胞由于印刷過程的細(xì)胞對齊方法，構(gòu)建體比RD構(gòu)建體上的那些更加對齊（圖4D）。

圖4 混合結(jié)構(gòu)中對齊細(xì)胞(AL)和隨機(jī)分布細(xì)胞(RD)的制造過程示意圖及其特點(diǎn)

4. 負(fù)載細(xì)胞的構(gòu)建體的體外細(xì)胞活性
一般來說，SCX基因在肌腱和韌帶的發(fā)育和再生中起著至關(guān)重要的作用，而TNMD對于這些組織的正確形成和成熟以及維持其機(jī)械特性和功能是必需的。因此，作者進(jìn)一步對其進(jìn)行了驗(yàn)證。免疫熒光圖像表明，AL構(gòu)建體中的SCX和TNMD比通過打印細(xì)胞排列過程獲得的RD構(gòu)建體中更發(fā)達(dá)（圖5A-B）�；�因表達(dá)檢測也是類似的結(jié)果，AL構(gòu)建體比RD構(gòu)建體具有更高的與肌腱形成相關(guān)的基因表達(dá)（圖5C）。這可能是由于新的打印策略誘導(dǎo)了細(xì)胞間相互作用的增加，這對于肌腱分化是必需的。此外，在原位打印和細(xì)胞培養(yǎng)10天和21天后測量了打印的混合結(jié)構(gòu)的拉伸性能。如圖5D所示，盡管生物墨水中使用了相同的生物墨水成分、印刷的混合結(jié)構(gòu)和細(xì)胞數(shù)量，但在21天時(shí)，AL構(gòu)建體中觀察到的楊氏模量比RD構(gòu)建體中的楊氏模量大得多。

圖5 負(fù)載細(xì)胞的構(gòu)建體的細(xì)胞檢測

5. 混合細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械特性
細(xì)胞構(gòu)建體較差的機(jī)械性能阻礙了它們在各種組織再生應(yīng)用中的使用。為了解決這個(gè)問題，作者使用不含細(xì)胞的甲基丙烯酸酯t-dECMP (t-dECMP-Ma)生物墨水作為混合細(xì)胞負(fù)載結(jié)構(gòu)中的機(jī)械支撐。通過選擇合適的光交聯(lián)和印刷條件表明UV交聯(lián)過程不會(huì)影響t-dECMM中的細(xì)胞對齊生物墨水（圖6）。在當(dāng)前的研究中，利用兩種生物活性水凝膠來實(shí)現(xiàn)對齊的充滿細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，與之前的研究相比，機(jī)械性能顯著改善。

綜上，本文使用改進(jìn)的生物打印工藝成功制造了具有機(jī)械穩(wěn)定且完全排列的細(xì)胞的含細(xì)胞結(jié)構(gòu)。該過程包括用充滿細(xì)胞的生物墨水填充薄模具，并打印生物墨水溶液中不含細(xì)胞的高濃度生物墨水。打印參數(shù)經(jīng)過精心選擇，以確保細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的排列和機(jī)械性能。所得結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞排列和高初始細(xì)胞活力，表明該過程的安全性。該研究所提出的生物打印細(xì)胞結(jié)構(gòu)是一種有前途的生物材料，可用于再生具有機(jī)械穩(wěn)定性的對齊組織結(jié)構(gòu)。

文章來源：

https://doi.org/10.1088/1758-5090/ace740