擠出式生物3D打印構建高度組織化結構用于骨骼肌組織工程

來源： EngineeringForLife

3D生物打印是一項參與構建組織工程材料的新興技術，目前已經開發(fā)了不同的打印系統(tǒng)。其中，基于擠壓的方法被證明最適合骨骼肌組織工程，因為它能夠以平行模式生產和沉積印刷纖維，從而很好地模仿天然骨骼肌組織結構。然而，此功能通常與細胞需求（例如細胞粘附和/或吸收性的動機）沒有很好的相關性。

為了克服這一障礙，來自羅馬大學生物系的C Gargioli聯合法國艾克斯-馬賽大學的S Testa團隊報告了一種新型基于擠出3D生物打印系統(tǒng)的開發(fā)和表征及其在小鼠模型中校正體積肌肉損失(VML)損傷的應用。通過基于PEG-纖維蛋白原的使用獲得了高度組織化的3D結構，其中小鼠肌肉祖細胞能夠分化成排列成對齊束的肌纖維，并且能夠在體外培養(yǎng)時自發(fā)收縮（圖1）。

相關研究成果以“A novel extrusion-based 3D bioprinting system for skeletal muscle tissue engineering”為題于2023年2月3日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 3D 生物打印和本體聚合過程的示意圖

1. 生物打印和散裝結構中肌纖維成熟、組織和同質性的體外分析
印刷系統(tǒng)在維持細胞粘附、增殖和分化等生物過程中的有效性通過使用鼠類中成血管細胞(Mabs)進行評估。單克隆抗體被添加到由PF組成的生物墨水中，PF是一種結合了天然和合成益處的光固化水凝膠。將獲得的生物打印結構在培養(yǎng)物中保存長達30天，以獲得完全分化的肌纖維（圖2A）。徑向位移表明在單個抽搐的收縮階段發(fā)生的位移，在生物打印條件下顯著更高（2.5倍）（圖2B）。此外，觀察到不同的抽搐方向性，平行于生物打印結構中的打印軸，而隨機定向在大塊結構中（圖2B）。

圖2 細胞化結構中肌肉分化時程的明場成像

在第30天，在肌肉分化后，針對肌肉分化標記物MyHC和結蛋白的整體免疫熒光分析對大塊和生物打印結構進行了分析（圖3A）。圖像分析證實，PF為Mab的維持提供了有利的微環(huán)境，能夠在兩種條件下增殖和融合以產生大的多核肌纖維（圖3B）。通過比較兩種條件下的肌纖維寬度、長度和連貫性，評估了生物打印結構中肌纖維尺寸更好組織和更大同質性的證據（圖3C）。與體積曲線相比，生物打印結構中的寬度分布似乎向更大的尺寸移動并且更尖銳（圖3C）。此外，與大塊肌纖維相比，生物打印結構中的肌纖維平均長度明顯更高（兩倍），這一點也通過偏移長度分布得到證實（圖3D)。

圖3 散裝和 3D 生物打印結構的免疫熒光分析

2. 構造部分的分化和纖維排列分析
散裝和生物打印結構都被快速冷凍以用于OCT鑄造以獲得冷凍切片。免疫熒光分析證實在兩種情況下都存在結蛋白陽性和MyHC陽性肌纖維（圖4A)）。細胞能夠產生自己的細胞外基質(ECM)，纖維周圍層粘連蛋白的存在證明了這一點，表明細胞已經成熟（圖4A）。

細胞密度是一種指示切片內細胞存在和定位的測量值，在生物打印結構中顯著更高，反映了肌纖維的更好分布，而在大塊結構中，細胞主要位于最外層（圖 4B）。此外，在生物打印條件下，在構造部分上測量的圓度和橫截面積分別較高和較低，表明肌纖維沿構造縱軸的排列更好（圖4C）；另一方面，大塊結構顯示出更大的橫截面積但較低的圓度，正如預期的那樣，肌纖維沒有定向在一個單一的方向上（圖4D）。

圖4 結構截面分析

3. 小鼠生物打印結構植入后 TA 體積恢復
最后，作者采用VML小鼠模型評估打印系統(tǒng)在再生醫(yī)學應用中的潛力。生物打印結構被植入物在宿主肌肉內整合30天。在對照小鼠中，TA 肌肉組織被消融，但沒有被人工構造取代。與對照相比，植入的TA中的組織區(qū)域完全恢復，而對照則相反地顯示組織恢復不良和不足（圖5A）。大量LacZ陽性細胞核被標記在重建組織的中央有核肌纖維內，證明組織良好（圖5B）。

圖5 對消融和植入的小鼠TAs的免疫熒光分析

來自植入結構的重建組織被證明具有適當的血管化，如富含LacZ陽性細胞核的區(qū)域所突出顯示平滑肌肌動蛋白(SMA)和血管性血友病因子(vWF)的陽性信號，分別標記血管肌肉壁和內皮細胞 (圖6A）。此外，呈現 LacZ 陽性細胞核的重建肌纖維已被證明是受神經支配的，正如通過磷酸神經絲 (pNF) 和α-金環(huán)蛇毒素 (BTX) 免疫染色對神經突觸前和突觸后結構的陽性標記所證明的那樣，證明在植入 3D 結構后，再生的TA肌肉內神經肌肉接頭的發(fā)展（圖6B）。在nLacZMabs重建的TA區(qū)域觀察到Pax7陽性衛(wèi)星細胞，表明重建了肌肉再生所需的干細胞生態(tài)位（圖6C）。

圖6 對3D生物打印結構中nLacZ-Mabs再生區(qū)域的更高放大倍數分析

4. 人體生物打印結構植入后TA體積恢復
為了評估將所提出的方法轉化為人類研究的可能性，已經進行了利用肌肉來源的載有hMSC 的生物打印結構的試點實驗。與上述實驗類似，在50% TA肌肉消融后，將具有人類細胞的結構植入小鼠后肢。外植 TA 的橫截面顯示兩個不同的區(qū)域，一個是宿主的天然肌肉，另一個是源自人類生物打印植入物的區(qū)域（圖7A）。盡管與鼠源性植入物相比，異種移植物形成的組織總體上看起來組織性較，但與許多人Lamin A/C (Lam A/C)陽性細胞核共定位的大 MyHC 陽性區(qū)域表明重建的肌肉組織來自人類，并且hMSC能夠生成與宿主消融TA整合的肌纖維（圖7B）。

圖7 植入載有hMSC的生物打印結構的小鼠TA橫截面的免疫熒光分析

對重建的TA組織進行更深入的分析顯示，具有橫向小肌纖維的組織區(qū)域更多，這些區(qū)域在連續(xù)部分被證明是中央成核和 Lamin A/C陽性（圖8A）。從人源性植入物重建的組織也顯示出適當的血管化和神經支配，正如血管（SMA和vWF）和神經特異性（pNF和BTX）標記物所揭示的陽性信號所強調的那樣（圖 8B-C）。此外，在一些纖維的外圍觀察到Pax7陽性衛(wèi)星細胞的存在，從而表明重建的TA具有再生潛力（圖8D）。

圖8 對源自人類細胞的重建 TA 區(qū)域進行更高放大倍數分析

在這項工作中，所提出的基于PF的無藻酸鹽擠出3D生物打印系統(tǒng)建立在僅使用PF作為構成細胞支架的水凝膠的基礎上，被證明是骨骼肌組織工程的一種新穎且具有競爭力的工具。所呈現的結果突出了這種創(chuàng)新印刷方法在兩個主要方面的潛力：一方面，獲得體外生物替代品的可能性顯示出能夠自發(fā)收縮的適當組織的肌纖維，這可以代表藥物篩選和肌病研究的生物平臺；另一方面，印刷結構在小鼠模型中恢復 VML 損傷的功效，包括小鼠和人源性肌源性祖細胞，表明所提出的方法可以代表再生醫(yī)學的顯著且有效的工具。

文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb573