實(shí)現(xiàn)3D膠原蛋白器官支架的高分辨率打印

來源： EngineeringForLife

基于微凝膠的支撐浴中的3D打印能夠使用柔軟和水狀的生物材料構(gòu)建復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，但低打印分辨率通常是其在組織工程中實(shí)際應(yīng)用的障礙。近日，來自大阪大學(xué)的Michiya Matsusaki團(tuán)隊(duì)通過使用含有檸檬酸三鈉（TSC）的工程蓋蘭膠（GG）微凝膠浴實(shí)現(xiàn)3D膠原蛋白器官支架的高分辨率打印。將TSC引入浴液系統(tǒng)不僅減輕了GG微凝膠的聚集，導(dǎo)致更均勻的浴形態(tài)，而且由于TSC的脫水作用，還抑制了膠原墨水在浴中的擴(kuò)散，這兩者都有助于提高打印分辨率。這項(xiàng)工作為開發(fā)用于高分辨率打印膠原蛋白的微凝膠浴提供了一種易于操作的策略，為體外3D器官構(gòu)建提供了另一種途徑。相關(guān)論文“3D printing of collagen scaffold with enhanced resolution in a citrate-modulated Gellan gum microgel bath”于2023年5月5日在線發(fā)表于雜志《Advanced Healthcare Materials》上。

在微凝膠浴中進(jìn)行3D打印，可以用柔軟且含水的生物材料打印復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。如圖1（a）所示，GG微凝膠浴支持注射印刷，通過噴嘴在浴中的程序化移動(dòng)，連續(xù)擠出膠原油墨以制造設(shè)計(jì)圖案。印刷過程中，微凝膠為墨水提供了機(jī)械支撐和固定，避免了印刷結(jié)構(gòu)在重力作用下的變形，如圖1（b）所示。GG微凝膠浴是通過將本體凝膠機(jī)械研磨成微凝膠片來制備的。如圖1（c）所示，通過該方法獲得的GG微凝膠通常具有大的粒徑和多分散性，因?yàn)樾〉奈⒛�膠由于氫鍵或離子相互作用而聚集，這不可避免地導(dǎo)致在該浴中印刷精度低。此外，流體膠原油墨在微凝膠之間的大間隙和空隙中的擴(kuò)散將導(dǎo)致印刷細(xì)絲的直徑更大和形態(tài)更不規(guī)則。為了克服這個(gè)問題，本工作開發(fā)了一種易于操作但有效的策略，基于Hofmeister效應(yīng)調(diào)節(jié)GG微凝膠浴，如圖1（d）所示。通過簡單地將合適的鹽引入浴中，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)小而均勻的微凝膠和抑制的墨水?dāng)U散，從而在新的GG微凝膠浴中可以實(shí)現(xiàn)提高的打印分辨率。

圖1 微凝膠打印過程和打印產(chǎn)品的方案

然后，研究者通過簡單的工藝制備了新版GG微凝膠浴（圖2（a））。GG本體凝膠之前是通過在100 °C下將GG粉末溶解在PBS中，然后在室溫下通過與鈉離子形成螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行凝膠化來制備的（圖2（b））。在浴中添加TSC導(dǎo)致均勻的微凝膠形態(tài)，顆粒尺寸顯著減�。▓D2（c-e））。如圖2（f）所示，由于其脫水行為，TSC的引入可能會降低GG分子在凝膠中的溶解度，并導(dǎo)致GG微凝膠的相分離，最終降低微凝膠之間表面的相互作用位點(diǎn)。因此，TSC的加入促進(jìn)了微凝膠的分散。

圖2 GG-TSC微凝膠浴的制備工藝和表征

為了揭示TSC對墨水凝膠化速度的影響，如圖3（a-b）所示，膠原溶液在凝膠化之前是透明的，但一旦凝膠化就會變成白色和不透明的，因此墨水的顏色變化可以用作監(jiān)測注入浴中后凝膠化過程的信號。通過測量墨絲的相對灰度值來量化墨水顏色隨時(shí)間的變化。圖3（c）顯示了不同浴中墨水的歸一化灰度值變化的比較，這表明TSC的添加導(dǎo)致膠原墨水的凝膠化速度更快。較快的凝膠化可歸因于TSC對蛋白質(zhì)（即膠原油墨）的鹽析效應(yīng)。完全凝膠化所需的時(shí)間如圖3（d）所示。

圖3 在浴中印刷膠原的凝膠化表征

為了證明TSC對打印分辨率的影響，在添加和不添加TSC的浴中打印膠原絲，并通過比較在一系列噴嘴移動(dòng)速度下打印的絲的平均直徑來評估分辨率。如圖4（a和b）所示，在含有TSC的浴中打印的所有膠原線都顯示出具有不同邊界的完整形狀。為了確定印刷的最佳TSC濃度，在具有不同TSC濃度的浴中印刷網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4（c））。如圖4（d）所示，盡管所有浴都可以打印出完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但打印細(xì)節(jié)在兩個(gè)細(xì)絲交叉區(qū)域的細(xì)絲直徑和位移方面有所不同。圖4（e）顯示了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中細(xì)絲平均直徑的比較。結(jié)果表明，隨著TSC濃度的增加，細(xì)絲直徑減小。

圖4 膠原油墨在有或沒有TSC的浴中印刷的相關(guān)表征

如圖5（a）所示，通過使用開發(fā)的GG-TSC微凝膠浴，可以成功印刷復(fù)雜的器官結(jié)構(gòu)。由于GG微凝膠和膠原油墨之間的化學(xué)差異，印刷樣品可以通過浸入乙醇/水（體積為1:1）中的0.5v/v%GA溶液中，在浴中直接交聯(lián)。圖5（b-l）顯示了在開發(fā)的GG-TSC浴系統(tǒng)中打印的人耳模型、手、全尺寸人類心臟瓣膜等結(jié)構(gòu)（圖5），證明了微凝膠浴的良好打印性。如圖5（l）所示，兩種色素在節(jié)段區(qū)域沒有任何融合的情況下被分配，這表明膠原模型內(nèi)部具有良好的結(jié)構(gòu)完整性。高打印分辨率使得通過3D打印技術(shù)復(fù)制功能器官成為可能。

圖5 3D模型和相應(yīng)的打印膠原蛋白產(chǎn)品

由于TSC是一種常見的水溶性食用食品添加劑，它可以很容易地通過水洗去除。經(jīng)洗滌和滅菌后，獲得的膠原樣品可用于與細(xì)胞共培養(yǎng)，用于組織工程。如圖6（a）所示，將HiPS CM細(xì)胞與膠原片共培養(yǎng)，活/死細(xì)胞染色顯示，細(xì)胞以非常高的活力（超過95%）緊密地分布在膠原片的表面上，這表明印刷產(chǎn)品具有良好的細(xì)胞兼容性（圖6（b））。在膠原上培養(yǎng)HiPS CM細(xì)胞7天后，膠原片表現(xiàn)出強(qiáng)烈的跳動(dòng)行為（圖6（c））。圖6（d）顯示了頻率為48 bpm的心臟跳動(dòng)的代表圖。HiPS-CM細(xì)胞的協(xié)同收縮表明單個(gè)細(xì)胞彼此之間具有良好的通信。如圖6（e）所示，H&e染色表明，HiPS-CM均勻地分布在膠原片的表面上，并緊密地相互附著，在片上形成細(xì)胞層。細(xì)胞層的協(xié)同搏動(dòng)有助于整體收縮力，并使整個(gè)膠原片能夠普遍運(yùn)動(dòng)。

圖6 生物毒性測試

綜上，本文開發(fā)了一種基于Hofmeister效應(yīng)的易于操作的策略，以調(diào)節(jié)GG微凝膠，用于膠原器官支架的高分辨率3D打印。在浴中引入TSC不僅防止了GG微凝膠的聚集，導(dǎo)致微凝膠在浴中的平均粒徑減小和良好的分散狀態(tài)，而且通過鹽析效應(yīng)加速凝膠化來抑制墨水?dāng)U散，這兩者都有助于提高GG浴中的打印分辨率。通過使用新一代GG微凝膠浴，可以高保真地打印包括手、耳朵甚至心臟結(jié)構(gòu)在內(nèi)的復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)。此外，TSC可以很容易地通過洗滌去除，因此印刷產(chǎn)品表現(xiàn)出良好的生物相容性。這項(xiàng)工作提供了一種簡單的策略來調(diào)節(jié)GG微凝膠以高分辨率打印膠原蛋白，為組織工程和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的體外器官構(gòu)建提供了一條替代途徑。



文章來源：

https://doi.org/10.1002/adhm.202301090